【正文】 5 基因工程載體本章教學目的和要求 ：n 掌握載體的概念，載體具備的條件，構建質?？寺≥d體的基本策略和過程；n 熟悉重要克隆載體的結構，特殊用途的載體；n 了解基因打靶載體，人工染色體克隆載體。n 重點：載體具備的條件，構建質?？寺≥d體的基本策略和過程。n 基因克隆的本質 是使目的基因在特定的條件下得到 擴增和表達 ，而目的基因本身無法進行復制和表達、不易進入受體細胞、不能穩(wěn)定維持，所以就必須借助于 “載體 ”及其 “寄主細胞 ”來實現(xiàn)。載體概念：n 在基因工程中，攜帶目的基因進入宿主細胞進行擴增和表達的工具。Characteristics of vectors for gene cloningMCSMarkerForeigngene基因工程克隆載體，必須具備以下條件：n ⑴ 復制子 repliconn ⑵ 具有合適的篩選標記，便于重組子的篩選。n ⑶ 具備多克隆位點（ MCS），便于外源基因插入。n ⑷ 自身分子量較小，拷貝數(shù)高。n ⑸ 在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定性高。 質粒載體（ plasimid vectors）（一）質粒載體的生物學特性（二）質粒載體的制備 （三）質粒載體的改造 （一）質粒的生物學特性（ 1） 質粒： 獨立于染色體以外的能自主復制的裸露的雙鏈環(huán)狀 (少數(shù)為線形和 RNA） DNA分子。p廣泛從在于細菌細胞中，比病毒更簡單。在霉菌、藍藻、酵母和一些動植物細胞中也發(fā)現(xiàn)了質粒，目前對細菌的質粒研究得比較深入，特別是大腸桿菌的質粒。p大腸桿菌的質粒主要有 F質粒（ F因子）、 R質粒（抗藥性因子）和 Col質粒（大腸桿菌素因子）三種。 （一）質粒的生物學特性（ 2） 質粒的存在形式 有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種（ 3） 賦予宿主細胞性狀 抗性基因n 物質抗性 抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物n 物質合成 抗生素、細菌毒素、有機堿抗菌素名稱 抗菌素作用方式 宿主菌抗性機理氨芐青霉素（ Amp） 干擾細菌細胞壁合成 編碼 ?內(nèi)酰胺酶 ,切割 Amp?內(nèi)酰胺環(huán)氯霉素（ Cml） 抑菌劑 ,與 50S結合 ,干擾 編碼乙酰轉移酶 ,使氯霉素蛋白質合成 乙酰化失活卡那霉素（ Kan） 殺菌劑 ,與 70S結合 ,mRNA編碼氨基糖苷磷酸轉移酶 ,發(fā)生錯讀 修飾 Kan失活鏈霉素（ Sm） 殺菌劑 ,與 30S結合 ,mRNA編碼特異修飾酶發(fā)生錯讀四環(huán)素（ Tet） 抑菌劑 ,與 30S結合，阻止 編碼特異蛋白 ,修飾細菌膜蛋白合成 結構 ,阻止 Tet通過細胞膜 （一）質粒的生物學特性（ 4） 質粒的大小 差異很大 ， 最小的只有 1kb,只能編碼中等大小的 23種蛋白質分子，最大的達到 200kb。（ 5） 質粒的生存 在寄主細胞中 “友好地借居 ”， 離開了寄主它本身無法復制；同時質粒往往有宿主專一性，如大腸桿菌的復制起點不一定能在其它生物細胞中繁殖。 （一）質粒的生物學特性（ 6） 質粒的復制類型 一種質粒在宿主細胞中存在的數(shù)目稱為該質粒的 拷貝數(shù)。 “嚴緊型 ”質粒（ stigent plasmid）： 拷貝數(shù)為 13；“松弛型 ”質粒（ relaxed plasmid）： 拷貝數(shù)為 1060。（ 7） 質粒的不相容性 沒有選擇壓力的情況下 ， 兩種親緣關系密切的質粒，不能夠長期穩(wěn)定的共存于同一宿主細胞中。（一）質粒的生物學特性（ 8） 質粒的轉移 接合型質粒分子量大嚴緊型復制 非接合型質粒分子量小松弛型復制 是否含有接合轉移基因 非轉移性質粒 ，不含 tra基因；可以為轉移性質粒所帶動轉移。轉移性質粒 ，含有 tra基因；能通過結合作用從一個細胞轉移到另一個細胞。在一般情況下，質粒的接合轉移能力與分子大小及復制型間有一定的相關性?，F(xiàn)歸納如下：（二）質粒 DNA的制備216。堿裂解法216。煮沸裂解法（三）質粒載體的改造 策略⑴ 去掉非必需的 DNA區(qū)段⑵ 減少限制性內(nèi)切酶的酶切位點的數(shù)目⑶ 加入易于撿出的選擇性標記基因氨芐青霉素抗性（ Ampr）四環(huán)素抗性（ Tetr)新霉素抗性（ Neor）氯霉素乙酰轉移酶（ CAT）卡那霉素抗性（ Kanr）⑷ 對質粒進行安全性改造，要求質粒不能隨便轉移。⑸ 改造或增加基因表達的調(diào)控序列。pBR322的構建 pBR322 pBR3224363結構：（ 1）氨芐青霉素抗性基因 （ampr或 Apr） 3種限制酶單一識別位點 （ 2）四環(huán)素抗性基因（ tetr或 Tcr）內(nèi)部有 7種，啟動區(qū)內(nèi)有 2種限制酶單一識別位點 （ 3） DNA復制起點（ ori）pBR322質粒的優(yōu)點：（ 1） 具有較小的分子量4363bp， 106Da，（ 2）具有 兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號。 （ 3）具 較高的拷貝數(shù) ，而且經(jīng)過氯霉素擴增之后 ,每個細胞中可累積 1000～ 3000個拷貝。（ 4）對多種常見的限制性內(nèi)切核酸酶只含有 一個能切割的位點 。 pBR3224363外源 DNApBR3224363PstI酶切PstI酶切黏性末端黏性末端連接酶 重組子 (ampstetr)空載體 (amprtetr)插入子 (ampstets) 野生型的 (ampstets) 導入涂布在含 Tc的平板上重組子轉化子 (ampstetr)空載體 轉化子 (amprtetr)影印在含 Ap的平板上 空載體 轉化子 (amprtetr)因插入外源 DNA而導致基因失活的現(xiàn)象稱之為 插入失活效應 。對比兩個平板上的菌落，凡在 Tc平板上生長而在 Ap平板上不能生長的菌落則是重組質粒轉化子克隆，挑選陽性克隆，分離出重組質粒。（ 1）四環(huán)素 ：（ 2）氨芐青霉素抗性基因pBR322抗菌素標記選擇產(chǎn)生 ?內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉