基因工程第6章dna重組的操作1(編輯修改稿)
2025-01-25 17:55 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 細胞或胚細胞現(xiàn)在：體細胞培養(yǎng)動物： 豬、羊、牛、魚、鼠、猴等216。 生產(chǎn)天然狀態(tài)的復(fù)雜蛋白質(zhì)216。 動物疫苗216。 動物品種的遺傳改良216。 人類疾病的基因治療第二節(jié) 重組體導(dǎo)入受體細胞 重組質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌 轉(zhuǎn)化（ transformation）216。定義216。轉(zhuǎn)化微生物的種類216。感受態(tài)細胞 P139216。轉(zhuǎn)化過程供體（ donor）：提供 DNA的生物受體（ recipient or host）：獲得 DNA的生物l 轉(zhuǎn)化 ：受體菌 直接吸收 供體菌的 DNA片斷而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象 。l 轉(zhuǎn)化子 （ transformant）： 通過轉(zhuǎn)化方式而形成的雜種后代。 首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象 肺炎鏈球菌（ Griffith,1928） 嗜血桿菌屬、芽孢桿菌屬、奈瑟氏球菌屬、根瘤菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬等。3. 感受態(tài) （ petence）感受態(tài)：指受體細胞最易接受外源 DNA片斷并能實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。感受態(tài)是細菌的一種遺傳特性，而且也受生長階段、培養(yǎng)條件的影響。肺炎鏈球菌 對數(shù)生長后期芽孢桿菌屬 指數(shù)期末和穩(wěn)定期大腸桿菌 剛進入對數(shù)期DH5α菌株的 OD600 為 ,細胞密度在 5107 個 /ml左右 大腸桿菌216。 革蘭氏陰性菌216。 細胞表面的結(jié)構(gòu)和組成與革蘭氏陽性菌不同216。 轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難216。 人工制備感受態(tài)細胞4. 轉(zhuǎn)化過程大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方法：216。 Ca 2＋ 誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法216。 電穿孔轉(zhuǎn)化法216。 三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Ca 2＋ 誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法216。 培養(yǎng) 生命活動旺盛的菌體 菌種分純活化，擴大培養(yǎng)，處于對數(shù)生長期216。 沉淀菌體 冰水浴中預(yù)冷 10分鐘， 4 ℃ 離心216。 化合物處理 含 CaCl2 無菌 預(yù)冷緩沖液處理216。 DNA分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞制備感受態(tài)細胞的注意事項1. 細胞生長狀態(tài)和密度 : l 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于４ ℃ 的培養(yǎng)菌，最好從 － 70℃ 或 － 20℃ 甘油保存的菌種 中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。l 細胞生長密度以剛進入 對數(shù)生長期 時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的 OD600 來控制。 DH5α菌株的 OD600 為 ,細胞密度在 5107 個 /ml左右 (不同的菌株情況有所不同 )，這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度 : l 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài) DNA(cccDNA)。l 轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比 ,但當加入的外源 DNA的量過多或體積過大時 ,轉(zhuǎn)化效率就會降低。 1ng的 cccDNA即可使 50μl 的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下 ,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細胞體積的 5％。 3. 試劑的質(zhì)量 : l 所用的試劑 ,如 CaCl2 等均需是最高純度的 (GR.或 AR.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。 4. 防止雜菌和雜 DNA的污染：l 整個操作過程均應(yīng)在 無菌條件下進行 ，所用器皿，如離心管， tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理， 所有的試劑都要滅菌 ，且注意防止被其它試劑、 DNA酶或雜 DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜 DNA的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選
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