基因工程第6章dna重組的操作1-wenkub
2023-01-26 17:55:13 本頁(yè)面
【正文】 亞群體?；厥盏?cDNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA后克隆倒適當(dāng)?shù)妮d體中，就成為一個(gè)減數(shù)文庫(kù)。Review第三部分 目的基因的分離目的序列已知：l 一般采用 PCR技術(shù)或分子雜交技術(shù)分離克隆目的基因 目的序列未知：l 差異表達(dá)序列l(wèi) 無(wú)差異表達(dá)的目的序列，可采用文庫(kù)篩選法、功能蛋白分離法、序列克隆法一、目的基因的功能克隆l 根據(jù)蛋白質(zhì)的基本生化特性這一功能信息，在獲知基因的功能后克隆l 其具體作法是 :在純化相應(yīng)的編碼蛋白后構(gòu)建 cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)，然后從文庫(kù)中篩選目的基因l (1)將純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸測(cè)序，據(jù)此合成 寡核苷酸探針 從 cDNA庫(kù)或基因組文庫(kù)中篩選編碼基因l (2)將相應(yīng)的編碼蛋白制成相應(yīng) 抗體探針 ，從 cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選相應(yīng)克隆。五、 mRNA差別顯示技術(shù)l 又稱(chēng)為差別顯示反轉(zhuǎn)錄 PCR（ DDRTPCR）l 目的序列未知， 1992年由美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)分校 DenaFarber研究所的兩位科學(xué)家 Liang和 Pardee首次提出的，并運(yùn)用這種方法來(lái)分離一對(duì)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中差別表達(dá)的基因。這一過(guò)程叫做 差異顯示反轉(zhuǎn)錄 ，即 DDRT。 幾乎可檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)的所有基因216。 12種錨定引物和 20種隨機(jī)引物， 240次 PCR216。 易于重組 DNA分子的導(dǎo)入216。 安全性高216。 有較高的應(yīng)用價(jià)值 原核生物細(xì)胞是較為理想的受體細(xì)胞216。 多為單細(xì)胞生物，繁殖迅速，過(guò)程簡(jiǎn)單缺陷：以原核生物表達(dá)真核生物基因存在問(wèn)題，很多真核生物基因不能在 能蛋白。 原核生物內(nèi)源蛋白易降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定常用受體菌：216。 基因結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的真核生物之一216。 可將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至胞外植物細(xì)胞216。水稻，棉花，玉米，馬鈴薯，煙草等動(dòng)物細(xì)胞早期：生殖細(xì)胞、受精卵細(xì)胞或胚細(xì)胞現(xiàn)在：體細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物： 豬、羊、牛、魚(yú)、鼠、猴等216。 人類(lèi)疾病的基因治療第二節(jié) 重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞 重組質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌 轉(zhuǎn)化（ transformation）216。轉(zhuǎn)化過(guò)程供體（ donor）：提供 DNA的生物受體（ recipient or host）：獲得 DNA的生物l 轉(zhuǎn)化 ：受體菌 直接吸收 供體菌的 DNA片斷而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象 。感受態(tài)是細(xì)菌的一種遺傳特性，而且也受生長(zhǎng)階段、培養(yǎng)條件的影響。 轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難216。 三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Ca 2＋ 誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法216。 DNA分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞的注意事項(xiàng)1. 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度 : l 不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４ ℃ 的培養(yǎng)菌，最好從 － 70℃ 或 － 20℃ 甘油保存的菌種 中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度 : l 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài) DNA(cccDNA)。 3. 試劑的質(zhì)量 : l 所用的試劑 ,如 CaCl2 等均需是最高純度的 (GR.或 AR.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。L1 CaCl2重懸， 4℃ 保存?zhèn)溆茫?7d內(nèi)可用。 二甲基亞楓（ DMSO ）、二硫蘇糖醇 （ DTT） 提高 100～ 1000倍，易污染216。感受態(tài)細(xì)胞有效性對(duì)照處理： 加入已知的容易轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA原因： 轉(zhuǎn)化處理過(guò)程中，可能感染雜菌，
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