【正文】 載體上。 1. 用一種在靶序列上沒有酶切位點的核酸限制性內(nèi)切酶消化DNA； 2. 產(chǎn)生大小不同的線性DNA片段群體，其中靶 DNA區(qū)段的DNA分子長度不超過 2~3kb，經(jīng)連接后重新環(huán)化； 3. 按靶序列設(shè)計的一對引物與互補序列退火結(jié)合，其延伸方向如箭頭所指； 反轉(zhuǎn)錄 PCR： Reverse transcriptase (RT)PCR ? PCR技術(shù)不僅可以擴增 DNA模板，還可以擴增反轉(zhuǎn)錄成 cDNA形式的 RNA。 ? 操作程序與 Soutern blotting類似。 探針的標記 ?Radioactive labeling: display and/or magnify the signals by radioactivity. ?Nonradioactive labeling: display and/or magnify the signals by antigen labeling: antibody binding – enzyme binding substrate application (signal release) ? Southern blotting ：將變性處理的后的 DNA片段進行凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜，再用放射性標記的探針進行雜交以顯示這些 DNA，這種技術(shù)成為 Southern blotting 。 ? 瓊脂糖（ Agarose） ? 聚丙烯酰胺（ Polyacrylamide） 溴化乙錠（ＥＢ） ? ＥＢ是具有扁平分子的核酸染料，能插入ＤＮＡ或者ＲＮＡ相鄰堿基之間，在300nm波長的紫外線照射下發(fā)出熒光。 ? 線性 DNA分子根據(jù)其分子量大小來分離?；蚬こ萄芯考夹g(shù) Preparation, analysis and manipulation of nucleic acids and proteins ? 所有的分子生物學(xué)技術(shù)都是基于對核酸和蛋白質(zhì)性質(zhì)研究的基礎(chǔ)上發(fā)展的 ? 雜交： the basepairing characteristics of DNA and RNA ? PCR： Thermophilic DNA polymerase ? DNA克隆 ： DNA polymerase, restriction endonucleases and DNA ligase 1. 核酸研究技術(shù) ? 電泳分離： Separation by Electrophoresis ? 限制性內(nèi)切酶切割： Cut by Restriction endonuclease ? 雜交鑒定： Identification by Hybridization ? PCR擴增： Amplification by PCR ? DNA克隆和基因表達： DNA Cloning and gene expression ? DNA文庫 的構(gòu)建和目的基因的篩選（ Construction of DNA library screening of target gene) ? 基因組序列和分析： Genome sequence analysis 1. 凝膠電泳是根據(jù) DNA和 RNA的分子量大小、拓撲結(jié)構(gòu)等性質(zhì)進行分離 ? 一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。分子量大的 DNA電泳速度比分子量小的DNA要慢。 ? 當 DNA和 RNA用 EB充分處理之后，其熒光強度與其分子量大小呈正比 9 瓊脂糖 (Agarose): (1) 分離效果比聚丙烯酰胺差 , (2) 能夠分離大分子 DNA，分子量高達幾十 Kb 1 kb kb 2 kb 3 kb 4 kb 10 聚丙稀酰胺 (Polyacrylamide): (1) 分離能力高 ， 能夠分辨相差一個堿基或者一個堿基對 的 DNA或者 RNA分子 (2) 只能分離小分子量大樣品 (1 to a few hundred bp). 11 (1) DNA分子的遷移方向隨電場方向的周期性變化而不斷改變 . (2) 根據(jù) DNA地分子量大小、拓撲結(jié)構(gòu)來分離樣品 . (3) 用來分離大分子的樣品，分子量超過 50Kb，甚至高達幾 M. Pulsedfield gel electrophoresis (脈沖場電泳 ) Switching between two orientations: the larger the DNA is, the longer it takes to reorient (1) RNA與 DNA類似，帶有負電荷； (2) RNA是 單鏈分子 ，很容易 自發(fā)形成分子內(nèi)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu) ，影響了電泳分離效果； (3) 用 乙二醛 處理 RNA，阻止 RNA的堿基配對，使得 RNA與ＤＮＡ一樣，電泳遷移率與分子量大小相關(guān) RNA也可以用電泳方法分離 2. 限制性內(nèi)切酶在特定位點切割DNA分子 ? 識別位點 ? 粘性末端 ? 平末端 ? 同裂酶 ? 同尾酶 3. DNA雜交 確定特殊的 DNA分子 ? 雜交（ Hybridization):不同來源的單鏈 DNA或者 RNA通過堿基配對形成互補結(jié)構(gòu)的過程 探針 Probe ? 探針：一段帶有特殊標記的核苷酸序列，可以用來從混合的核苷酸中尋找含有與其序列互補的核苷酸序列。 ? Northern blotting ：將 RNA從瓊脂糖凝膠電泳轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜，再用放射性標記的探針進行雜交的技術(shù)。先將蛋白質(zhì)經(jīng)過 SDSPAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素薄膜之類的固體支持物上，通過專一性抗體探測目標蛋白質(zhì)；隨后用標記的第二抗體檢測在印跡中是否存在免疫復(fù)合物（一抗與抗原的復(fù)合物）。這種在mRNA反轉(zhuǎn)錄之后進行的 PCR成為反轉(zhuǎn)錄PCR。 ? 基因組文庫： 把某種生物的基因組 DNA切割成適當大小的片段，這些片段分別與載體連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進宿主細胞，這樣的 DNA文庫稱為基因組文庫。但是由于要分離的目的基因往往是未知基因，因此無法對它進行特異性擴增，而只能對所有的基因進行擴增，也就是構(gòu)建該生物材料的基因文庫，然后再根據(jù)不同的方法將所需的克隆篩選出來，最后分離得到目的基因。 2. 載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆。 基因組 DNA文庫構(gòu)建的程序 1. 載體 DNA的制備； 2. 高純度大相對分子質(zhì)量基因組 DNA的提取和大片段的制備； 3. 高純度大相對分子質(zhì)量基因組 DNA的部分酶切與脈沖電泳分級分離； 4. 載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細胞； 5. 重組克隆的挑選和保存 。 （ 1） 粘性末端直接連接 ：載體與外源 DNA大片段的兩個末端都有相同的粘性末端 。 HB101: 用于大規(guī)模制備質(zhì)粒的抑制型菌株，轉(zhuǎn)化效率高 JM101: 可支持帶有琥珀突變載體生長的宿主菌 JM109: 支持帶有琥珀突變載體生長的重組缺陷的抑制型菌 MZ1: 溫度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌體Ｐ Ｌ 啟動子質(zhì)粒載體 的宿主菌 一、基因組 DNA文庫的構(gòu)建 構(gòu)建DNA文庫的方法 anneal Reverse transcription Regular PCR Construction of cDNA library Colony screening 1. Antibiotic screening (抗生素選擇 )： only the rebinant plasmids grow on the antibioticcontaining plate. 2. Bluewhite screening (藍白斑選擇 ): DNA insertion in the vector shuts down the LacZ gene expression, and turns the colony to white. 3. Colony hybridization screening (菌落雜交篩選 ) from a library. Antibiotic screening： only intact plasmids grow on the antibioticcontaining plate. 篩選方法 1：抗生素選擇 Ampr ori pUC18 (3 kb) MCS (Multiple cloning sites, 多克隆位點） Lac promoter lacZ’ Insertion of a DNA fragment interrupts the ORF of lacZ’ gene, resulting in nonfunctional gene product that can not digest its substrate xgal. 篩選方法 2：藍白斑篩選 Transfer to nitrocellulose or nylon membrane Denature DNA(NaOH) Bake onto membrane Probe with 32plabled DNA plementary to gene of interest Expose to film Select positive from master plate Keep master plate Screening by plaque hybridization 篩選方法 3：菌落原位雜交 Analysis of a clone 1. Re