【正文】 基因工程研究技術 Preparation, analysis and manipulation of nucleic acids and proteins ? 所有的分子生物學技術都是基于對核酸和蛋白質性質研究的基礎上發(fā)展的 ? 雜交： the basepairing characteristics of DNA and RNA ? PCR： Thermophilic DNA polymerase ? DNA克隆 ： DNA polymerase, restriction endonucleases and DNA ligase 1. 核酸研究技術 ? 電泳分離： Separation by Electrophoresis ? 限制性內切酶切割： Cut by Restriction endonuclease ? 雜交鑒定： Identification by Hybridization ? PCR擴增： Amplification by PCR ? DNA克隆和基因表達： DNA Cloning and gene expression ? DNA文庫 的構建和目的基因的篩選（ Construction of DNA library screening of target gene) ? 基因組序列和分析： Genome sequence analysis 1. 凝膠電泳是根據(jù) DNA和 RNA的分子量大小、拓撲結構等性質進行分離 ? 一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率； ? 電泳的遷移率與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。 ? DNA、 RNA由于其骨架中的磷酸基團呈離子化狀態(tài)，帶有負電荷，在電場中向正電極移動。 ? 線性 DNA分子根據(jù)其分子量大小來分離。分子量大的 DNA電泳速度比分子量小的DNA要慢。 ? 環(huán)狀 DNA的電泳速度與其拓撲結構相關。不同構型，相同大小分子量的 DNA的電泳速度是： SC DNAL DNAOC DNA Gel matrix (膠支持物 ) ? 膠支持物是凝膠狀的多孔物質，能允許DNA分子通過其內部的孔隙。 ? 瓊脂糖（ Agarose） ? 聚丙烯酰胺（ Polyacrylamide） 溴化乙錠（ＥＢ） ? ＥＢ是具有扁平分子的核酸染料，能插入ＤＮＡ或者ＲＮＡ相鄰堿基之間，在300nm波長的紫外線照射下發(fā)出熒光。 ? 當 DNA和 RNA用 EB充分處理之后，其熒光強度與其分子量大小呈正比 9 瓊脂糖 (Agarose): (1) 分離效果比聚丙烯酰胺差 , (2) 能夠分離大分子 DNA，分子量高達幾十 Kb 1 kb kb 2 kb 3 kb 4 kb 10 聚丙稀酰胺 (Polyacrylamide): (1) 分離能力高 ， 能夠分辨相差一個堿基或者一個堿基對 的 DNA或者 RNA分子 (2) 只能分離小分子量大樣品 (1 to a few hundred bp). 11 (1) DNA分子的遷移方向隨電場方向的周期性變化而不斷改變 . (2) 根據(jù) DNA地分子量大小、拓撲結構來分離樣品 . (3) 用來分離大分子的樣品，分子量超過 50Kb，甚至高達幾 M. Pulsedfield gel electrophoresis (脈沖場電泳 ) Switching between two orientations: the larger the DNA is, the longer it takes to reorient (1) RNA與 DNA類似，帶有負電荷； (2) RNA是 單鏈分子 ，很容易 自發(fā)形成分子內的二級結構和三級結構 ，影響了電泳分離效果； (3) 用 乙二醛 處理 RNA，阻止 RNA的堿基配對，使得 RNA與ＤＮＡ一樣，電泳遷移率與分子量大小相關 RNA也可以用電泳方法分離 2. 限制性內切酶在特定位點切割DNA分子 ? 識別位點 ? 粘性末端 ? 平末端 ? 同裂酶 ? 同尾酶 3. DNA雜交 確定特殊的 DNA分子 ? 雜交（ Hybridization):不同來源的單鏈 DNA或者 RNA通過堿基配對形成互補結構的過程 探針 Probe ? 探針：一段帶有特殊標記的核苷酸序列，可以用來從混合的核苷酸中尋找含有與其序列互補的核苷酸序列。 ? 將要用探針雜交的混合核苷酸可以在電泳分離后的凝膠上，也可以在一個文庫的不同的克隆中。 ? 探針在雜交之前需要進行標記，以便于在探針與目標序列雜交后能夠被檢測出。 探針的標記 ?Radioactive labeling: display and/or magnify the signals by radioactivity. ?Nonradioactive labeling: display and/or magnify the signals by antigen labeling: antibody binding – enzyme binding substrate application (signal release) ? Southern blotting ：將變性處理的后的 DNA片段進行凝膠電泳后，轉移至硝酸纖維素薄膜，再用放射性標記的探針進行雜交以顯示這些 DNA，這種技術成為 Southern blotting 。 ? Northern blotting ：將 RNA從瓊脂糖凝膠電泳轉移至轉移至硝酸纖維素薄膜，再用放射性標記的探針進行雜交的技術。其原理與Southern blotting類似。 探針雜交可以確認電泳分離后的DNA和 RNA Northern/Southern blot analysis gel membrane Electrophoresis blotting Hybridization Southern and Northern blotting DNA on blot RNA on blot 1. Genomic DNA preparation RNA preparation 2. Restriction digestion 3. Denature with alkali 4. Agarose gel electrophoresis ? 5. DNA blotting/transfer and fixation RNA 6. Probe labeling ? 6. Hybridization (temperature) ? 7. Signal detection (Xray film or antibody) ? Western blotting ? Western blotting： 又稱為蛋白質印跡法，用來檢測在不均一的蛋白質樣品中是否存在目標蛋白質的技術。 ? 操作程序與 Soutern blotting類似。先將蛋白質經過 SDSPAGE電泳分離，然后轉移至醋酸纖維素薄膜之類的固體支持物上，通過專一性抗體探測目標蛋白質；隨后用標記的第二抗體檢測在印跡中是否存在免疫復合物（一抗與抗原的復合物）。 22 Blot type Target Probe Applications Southern DNA DNA or RNA mapping genomic clones estimating gene numbers, etc Northern RNA DNA or RNA RNA sizes and abundance (gene expression level) Western Protein Antibodies protein size and abundance (gene expression level) Comparison of Southern, Northern and Western bolt hybridization 4. 聚合酶鏈式反應 (PCR) PCR is to used to amplify a DNA sequence using a pair of primers each plementary to one end of the DNA target sequence. ? Denaturation (變性 ): The target DNA (template) is separated into two stands by heating to 95℃ ? Primer annealing (退火 ): The temperature is reduced to around 55℃ to allow the primers to anneal. ? Polymerization (elongation, extension) (延伸 ): The temperature is increased to 72℃ for optimal polymerization step which uses up dNTPs and required Mg2+. The PCR cycle: Three different steps pr