【正文】 基因工程研究技術(shù) Preparation, analysis and manipulation of nucleic acids and proteins ? 所有的分子生物學(xué)技術(shù)都是基于對(duì)核酸和蛋白質(zhì)性質(zhì)研究的基礎(chǔ)上發(fā)展的 ? 雜交： the basepairing characteristics of DNA and RNA ? PCR： Thermophilic DNA polymerase ? DNA克隆 ： DNA polymerase, restriction endonucleases and DNA ligase 1. 核酸研究技術(shù) ? 電泳分離： Separation by Electrophoresis ? 限制性?xún)?nèi)切酶切割： Cut by Restriction endonuclease ? 雜交鑒定： Identification by Hybridization ? PCR擴(kuò)增： Amplification by PCR ? DNA克隆和基因表達(dá)： DNA Cloning and gene expression ? DNA文庫(kù) 的構(gòu)建和目的基因的篩選（ Construction of DNA library screening of target gene) ? 基因組序列和分析： Genome sequence analysis 1. 凝膠電泳是根據(jù) DNA和 RNA的分子量大小、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等性質(zhì)進(jìn)行分離 ? 一種分子被放置到電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率； ? 電泳的遷移率與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。 ? DNA、 RNA由于其骨架中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，帶有負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正電極移動(dòng)。 ? 線性 DNA分子根據(jù)其分子量大小來(lái)分離。分子量大的 DNA電泳速度比分子量小的DNA要慢。 ? 環(huán)狀 DNA的電泳速度與其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相關(guān)。不同構(gòu)型，相同大小分子量的 DNA的電泳速度是： SC DNAL DNAOC DNA Gel matrix (膠支持物 ) ? 膠支持物是凝膠狀的多孔物質(zhì)，能允許DNA分子通過(guò)其內(nèi)部的孔隙。 ? 瓊脂糖（ Agarose） ? 聚丙烯酰胺（ Polyacrylamide） 溴化乙錠（ＥＢ） ? ＥＢ是具有扁平分子的核酸染料，能插入ＤＮＡ或者ＲＮＡ相鄰堿基之間，在300nm波長(zhǎng)的紫外線照射下發(fā)出熒光。 ? 當(dāng) DNA和 RNA用 EB充分處理之后，其熒光強(qiáng)度與其分子量大小呈正比 9 瓊脂糖 (Agarose): (1) 分離效果比聚丙烯酰胺差 , (2) 能夠分離大分子 DNA，分子量高達(dá)幾十 Kb 1 kb kb 2 kb 3 kb 4 kb 10 聚丙稀酰胺 (Polyacrylamide): (1) 分離能力高 ， 能夠分辨相差一個(gè)堿基或者一個(gè)堿基對(duì) 的 DNA或者 RNA分子 (2) 只能分離小分子量大樣品 (1 to a few hundred bp). 11 (1) DNA分子的遷移方向隨電場(chǎng)方向的周期性變化而不斷改變 . (2) 根據(jù) DNA地分子量大小、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來(lái)分離樣品 . (3) 用來(lái)分離大分子的樣品，分子量超過(guò) 50Kb，甚至高達(dá)幾 M. Pulsedfield gel electrophoresis (脈沖場(chǎng)電泳 ) Switching between two orientations: the larger the DNA is, the longer it takes to reorient (1) RNA與 DNA類(lèi)似，帶有負(fù)電荷； (2) RNA是 單鏈分子 ，很容易 自發(fā)形成分子內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu) ，影響了電泳分離效果； (3) 用 乙二醛 處理 RNA，阻止 RNA的堿基配對(duì)，使得 RNA與ＤＮＡ一樣，電泳遷移率與分子量大小相關(guān) RNA也可以用電泳方法分離 2. 限制性?xún)?nèi)切酶在特定位點(diǎn)切割DNA分子 ? 識(shí)別位點(diǎn) ? 粘性末端 ? 平末端 ? 同裂酶 ? 同尾酶 3. DNA雜交 確定特殊的 DNA分子 ? 雜交（ Hybridization):不同來(lái)源的單鏈 DNA或者 RNA通過(guò)堿基配對(duì)形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的過(guò)程 探針 Probe ? 探針：一段帶有特殊標(biāo)記的核苷酸序列，可以用來(lái)從混合的核苷酸中尋找含有與其序列互補(bǔ)的核苷酸序列。 ? 將要用探針雜交的混合核苷酸可以在電泳分離后的凝膠上，也可以在一個(gè)文庫(kù)的不同的克隆中。 ? 探針在雜交之前需要進(jìn)行標(biāo)記，以便于在探針與目標(biāo)序列雜交后能夠被檢測(cè)出。 探針的標(biāo)記 ?Radioactive labeling: display and/or magnify the signals by radioactivity. ?Nonradioactive labeling: display and/or magnify the signals by antigen labeling: antibody binding – enzyme binding substrate application (signal release) ? Southern blotting ：將變性處理的后的 DNA片段進(jìn)行凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜，再用放射性標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交以顯示這些 DNA，這種技術(shù)成為 Southern blotting 。 ? Northern blotting ：將 RNA從瓊脂糖凝膠電泳轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜，再用放射性標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交的技術(shù)。其原理與Southern blotting類(lèi)似。 探針雜交可以確認(rèn)電泳分離后的DNA和 RNA Northern/Southern blot analysis gel membrane Electrophoresis blotting Hybridization Southern and Northern blotting DNA on blot RNA on blot 1. Genomic DNA preparation RNA preparation 2. Restriction digestion 3. Denature with alkali 4. Agarose gel electrophoresis ? 5. DNA blotting/transfer and fixation RNA 6. Probe labeling ? 6. Hybridization (temperature) ? 7. Signal detection (Xray film or antibody) ? Western blotting ? Western blotting： 又稱(chēng)為蛋白質(zhì)印跡法，用來(lái)檢測(cè)在不均一的蛋白質(zhì)樣品中是否存在目標(biāo)蛋白質(zhì)的技術(shù)。 ? 操作程序與 Soutern blotting類(lèi)似。先將蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò) SDSPAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素薄膜之類(lèi)的固體支持物上，通過(guò)專(zhuān)一性抗體探測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)；隨后用標(biāo)記的第二抗體檢測(cè)在印跡中是否存在免疫復(fù)合物（一抗與抗原的復(fù)合物）。 22 Blot type Target Probe Applications Southern DNA DNA or RNA mapping genomic clones estimating gene numbers, etc Northern RNA DNA or RNA RNA sizes and abundance (gene expression level) Western Protein Antibodies protein size and abundance (gene expression level) Comparison of Southern, Northern and Western bolt hybridization 4. 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) PCR is to used to amplify a DNA sequence using a pair of primers each plementary to one end of the DNA target sequence. ? Denaturation (變性 ): The target DNA (template) is separated into two stands by heating to 95℃ ? Primer annealing (退火 ): The temperature is reduced to around 55℃ to allow the primers to anneal. ? Polymerization (elongation, extension) (延伸 ): The temperature is increased to 72℃ for optimal polymerization step which uses up dNTPs and required Mg2+. The PCR cycle: Three different steps pr