【正文】 according to the length of individual polypeptide. ? After electrophoresis, the proteins can be visualized with a stain, such as Coomassie brilliant blue (考馬氏亮藍(lán) ). ? Proteins from the PAGE gel can be transferred to a membrane, followed by a western analysis of the target protein by a corresponding antibody. 107 4. Protein sequencing (蛋白質(zhì)測(cè)序 ) ? Two sequence method: Edman degradation (Edman切割法 ) Tandem mass spectrometry (MS/MS) (串連質(zhì)譜 ). ? Due to the vast resource of plete or nearly plete genome, the determination of even a small stretch of protein sequence is sufficient to identify the gene. 5. Proteomics (蛋白質(zhì)組學(xué) ) ? Proteomics is concerned with the identification of the full set of proteins produced by a cell or a tissue under a particular by a particular set of conditions. 蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)（ protein）和基因組（ genome）研究在形式和內(nèi)容兩方面的組合，該技術(shù)致力于研究某一物種、個(gè)體、器官、組織或細(xì)胞在特定條件、特定時(shí)間所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)圖譜。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的三種方法 1. 雙向電泳 for protein separation (蛋白質(zhì)分離 ). 2. 質(zhì)譜分析 for the precise determination of the molecular weight and identify of a protein (蛋白質(zhì)鑒定 ). 3. Bioinformatics for assigning proteins and peptides to the predicted products of protein coding sequence in the genome (蛋白質(zhì)確定 ). 雙向電泳 (Two－ Dimensional Electrophoresis， 2D)技術(shù) : 等電聚焦（ Isoelectric focusing）及 SDS聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳技術(shù)。蛋白質(zhì)是兩性分子，在不同 pH緩沖液中表現(xiàn)出不同的帶電性，因此，在兩性電解質(zhì)電泳體系中，不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)會(huì)聚集在介質(zhì)上不同的區(qū)域（等電點(diǎn)）從而被分離。 111 蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究方法 Gel retardation (凝膠阻滯 ) 凝膠滯緩試驗(yàn)（ gel retardation assay），又叫作 DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)（ DNA mobility shift assay），是用于體外研究 DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。 在凝膠電泳中，由于電場(chǎng)的作用，裸露的 DNA朝正電極移動(dòng)的距離與其分子量的對(duì)數(shù)成反比。如果此時(shí) DNA分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合，那么，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會(huì)受到阻滯，在特定電壓和時(shí)間內(nèi)朝正電極移動(dòng)的距離也就相應(yīng)縮短了。 DNA bound to two proteins DNAprotein plex Bare DNA A DNA bound with more than one protein to form a larger plex. DNase I footprinting (DNase I 足跡法 ) 確定 DNA上與蛋白質(zhì)結(jié)合的精確位點(diǎn) 5’ * Sequence ladder is required to determine the precise position AATAAG ? 一種確定 DNA結(jié)合蛋白在 DNA分子上的結(jié)合位點(diǎn)的方法。 ? 原理：將含有特定順式元件的雙鏈 DNA片段進(jìn)行單鏈單末端標(biāo)記，與初步純化的 DNA結(jié)合蛋白在體外行結(jié)合作用，然后加入 DNase I對(duì) DNA一蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行隨機(jī)切割，產(chǎn)生一系列不同長(zhǎng)度的DNA片段，其相鄰片段只相差一個(gè)核苷酸。 DNA結(jié)合蛋白與其特異序列結(jié)合后，由于空間位阻等多種效應(yīng)， DNase I不能對(duì)其進(jìn)行切割 . Bind protein DNase(mild),then remove protein and denature DNA DNase footprinting （ 1） The protein protects DNA from attack by DNase. （ 2） Treat the DNAprotein plex with DNase I under mild conditions, so that an average of only one cut occur per DNA molecule. Electrophoresis, autoradiograph 0 1 5 [Protein] The three lanes represent DNA that was bound to 0, 1, and 5 units of protein. The lane with no protein shows a regular ladder of fragments. The lane with one unit shows some protection, and the lane with 5 units shows plete protection in the middle. By including sequencing ladders, we can tell exactly where the protein bound. T C G G A G C A A C G C A A A C A A A C G T G C T T G G Determining the Structure of Protein and nucleic acids 1. Xray crystallography (X晶體衍射 ) 2. NMR (核磁共振 ) Xray crystallography Determining the tertiary structure X射線晶體衍射結(jié)構(gòu)分析法 (Xray crystallography): ?測(cè)定 X射線穿過晶體時(shí)候產(chǎn)生的衍射斑的位置和強(qiáng)度，繪制蛋白質(zhì)分子的電子密度圖；結(jié)合蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)和二硫鍵信息，解出蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象。 ?確定多肽鏈上所有原子空間排布，氫原子除外 ?A very powerful tool in understanding protein tertiary structure（三級(jí)結(jié)構(gòu)） X射線衍射結(jié)構(gòu)分析的步驟 ? 制備蛋白質(zhì)晶體 ? 收集處理衍射數(shù)據(jù) ? 計(jì)算電子密度圖 ? 解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) ?Many proteins have been crystallized and analyzed The ribosome structure and its interaction with mRNA and tRNA ?根據(jù)電場(chǎng)中質(zhì)子的核磁共振波譜確定蛋白質(zhì)的構(gòu)象 ?確定液體中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，不同于 X射線衍射法 ?Protein measured are usually smaller than 30 KDa. 核磁共振法（ NMR） 與 X射線衍射結(jié)構(gòu)分析法的比較 ? X射線衍射結(jié)構(gòu)分析法常常會(huì)破壞蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象， NMR不會(huì)； ? X射線衍射結(jié)構(gòu)分析法只能測(cè)定晶體蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象， NMR能夠測(cè)定溶液中的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象 ? X射線衍射結(jié)構(gòu)分析法只能測(cè)定靜態(tài)構(gòu)象，而 NMR蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的變化過程 NMR的應(yīng)用 ? 測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象； ? 測(cè)定各種因子（溫度， pH，變性劑）對(duì)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的影響； ? 研究底物、產(chǎn)物、抑制劑、輔基、效應(yīng)物與酶分子的相互作用，獲得結(jié)構(gòu)中心的信息； ? 研究相同或者不同蛋白質(zhì)之間的相互作用或核酸蛋白質(zhì)之間的相互作用。 核酸研究技術(shù) : Electrophoresis。 Restriction digestion。 Hybridization (southern northern)。 PCR amplification。 sequencing and genome sequencing。 DNA cloning and gene expression. 蛋白質(zhì)研究技術(shù) : Protein purification。 affinity chromatography。 Protein separation and identification by western blot。 Protein sequencing。 Proteomics. 核酸與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù) Gel retardation Nuclease protection assays 研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的技術(shù) Xray crystallography, NMR