基因工程-第3章-核酸操作的基本技術(shù)(編輯修改稿)
2025-01-26 10:20 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ） 加 200μl新配制的溶菌酶溶液 (10mg/ml溶于10mM TrisCl， )， 混勻 。 ? 4） 加入 4ml新配制的溶液 Ⅱ ， 緩慢顛倒數(shù)次 ，充分混勻內(nèi)容物 ， 于室溫放置 510min。 ? 5） 加 2ml用冰預(yù)冷的溶液 Ⅲ ， 將離心管顛倒數(shù)次 ， 冰浴 15min。 12023rpm， 4℃ 離心 ? 20min。 ? 6） 將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中 ， 加 異丙醇 ， 充分混勻 ， 于室溫放置 10min。 ? 10000rpm， 室溫離心 15min， 回收質(zhì)粒沉淀 。 7）去除上清 ， 用 70%乙醇洗沉淀一次 ， 稍抽干 ，溶于 1ml TE中 。 ? 8） 加入 5μl RNase A（ 5mg/ml） ， 37℃ 消化 1hr。 ? 9） 轉(zhuǎn)移至小離心管 ， 用等體積的苯酚 ， 苯酚 ∶ 氯仿 ， 氯仿 ， 各抽提一次 。 ? 10） 加入 1/5體積的 10M NH4AC， 再加入 2倍體積的無水乙醇 ， 混勻 ， 室溫放置 30m i n。12023rpm， 室溫離心 10min。 ? 11） 棄上清 ， 70%乙醇洗沉淀兩次 ， 真空抽干 ，溶于適量 TE中 ， 儲存于 20℃ 。 質(zhì)粒ＤＮＡ的純化 ?１、聚乙二醇沉淀法純化質(zhì)粒ＤＮＡ ?２、氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)ＤＮＡ ?３、從質(zhì)粒ＤＮＡ制品中去除ＲＮＡ ?（１）通過１ mol/L NaCl進行離心 ?（２）通過 BioGel A150m或 Sepharose CL4B進行層析 基因組或其他ＤＮＡ的抽提 ? 細菌基因組ＤＮＡ的制備 ? 以微量制備法為例： ? １、５ ml細菌培養(yǎng)液生長至對數(shù)生長期。取 min. ? 用 567ulＴＥ緩沖液重新懸浮沉淀，加入30ul的１０％的ＳＤＳ 和 3ul的 20mg/ml 蛋白酶Ｋ，混合。在３７ ℃ 下保溫１ h。 ? ３、加入 100ul的５ mol/L NaCl，完全混合，再加入 80ulCTABNaCl溶液，混合。在 65 ℃ 下保溫 10min。 (CTAB,十六烷基三甲基溴化銨 ) ? ４、加入等體積的酚－氯仿－異戊醇，混合。離心４－５ min，將上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管中。 ? ５、按上述步驟重復(fù)抽提。將上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管中。 ? ６、加入 ，輕輕混合直至ＤＮＡ沉淀。用 70%乙醇洗一下沉淀。離心５min，棄去上清液后真空干燥。用 100ulＴＥ緩沖液重新懸?。模危?。 哺乳動物細胞基因組ＤＮＡ的抽提 ?哺乳動物基因組 DNA通常先用 SDS等裂解 ,再用苯酚抽提進行分離。用這類方法產(chǎn)生的 DNA長度（ 100150kb）適用于Southern分析和用 λ噬菌體構(gòu)建基因組文庫。 ? 哺乳動物組織細胞的 DNA提取 ? 組織樣保存在 70%乙醇中，－ 20℃ 凍存。提取ＤＮＡ?xí)r組織樣需研碎，乙醇揮發(fā)掉，提取方法同質(zhì)粒的ＤＮＡ提取法。 ? 哺乳動物血液基因組 DNA的提取 ? （ 1）取 750ul凍存血加入等量 PBS，混合均勻 ? （ 2） 12023rpm離心 5分鐘，棄上清 ? （ 3）加入 450ul DNA提取 buffer,重懸沉淀 ? （ 4）加入 Rnase至終濃度 20ug/ml， 37℃ 溫育 1小時 ? (5)加入蛋白酶 K至終濃度 100ug/ml,混勻， 55℃水浴消化過夜 ? (6)加入等體積Ｔ ris飽合酚，溫和搖動 10分
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