【文章內(nèi)容簡介】 酶 催化多聚核苷酸 5180。羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針 末端轉(zhuǎn)移酶 在 3180。羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾 堿性磷酸酶 切除末端磷酸基 限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease) 限 制 性 核 酸 內(nèi) 切 酶 ( r e s t r i c t i o n endonuclease, RE)是 識別 DNA的特異序列 , 并在識別位點(diǎn) 切割 雙鏈 DNA的一類 內(nèi)切酶 。 Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + 定義： “分子剪刀”的發(fā)現(xiàn)者 與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng) ， 限制外源 DNA， 保護(hù)自身 DNA。 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ （基因工程技術(shù)中 常用 Ⅱ 型 ） 分類： 作用： 第一個字母 取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名 ， 用 大寫 ； 第二、第三個字母 是該細(xì)菌的種名，用 小寫 ； 第四個字母代表株； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 命名： Hin dⅢ 屬 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血桿菌 d株的第三種酶 Ⅱ 類酶識別序列特點(diǎn) —— 回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 切口 ： 平端切口、粘端切口 GGATCC CCTAGG Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 粘端切口 來源不同 的限制酶 ， 但能 識別和切割同一位點(diǎn) ， 這些酶稱同功異源酶 。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + BstⅠ 同功異源酶： 有些限制性內(nèi)切酶雖然識別 序列不完全相同 ， 但切割 DNA后 ， 產(chǎn)生相同的粘性末端 ， 稱為同尾酶 。 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A 同尾酶 名 稱 識別序列及切割位點(diǎn) 名 稱 識別序列及切割點(diǎn) 切割后產(chǎn)生５ ’突出末端 : BamHⅠ 5’…G ▼GATCC...3’ Bgl Ⅱ 5’…A ▼GATCT...3’ EcoR Ⅰ 5’…G ▼AATTC...3’ Hind Ⅲ 5’…A ▼AGCTT...3’ Hpa Ⅱ 5’…C ▼CGG...3’ Mbo Ⅰ 5’… ▼GATC...3’ Nde Ⅰ 5’…GA ▼TATG...3’ 切割后產(chǎn)生 3’突出末端 : Apa Ⅰ 5’…GGGCC ▼C...3’ Hae Ⅱ 5’…PuGCGC ▼Py...3’ Kpn Ⅰ 5’…GGTAC ▼C...3’ Pst Ⅰ 5’…CTGCA ▼G...3’ Sph Ⅰ 5’…GCATG ▼C...3’ 切割后產(chǎn)生平末端 : Alu Ⅰ 5’…AG ▼CT...3’ EcoR Ⅴ 5’…GAT ▼ATC...3’ Hae Ⅲ 5’…GG ▼CC...3’ Pvu Ⅱ 5’…CAG ▼CTG...3’ Sma Ⅰ 5’…CCC ▼GGG...3’ 限制性內(nèi)切核酸酶 ?cDNA (plementary DNA) 指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與 RNA (通常指mRNA或病毒 RNA)互補(bǔ)的單鏈 DNA。以單鏈 cDNA為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈 cDNA。 ?基因組 DNA (genomic DNA) 指代表一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體 )的所有 DNA序列。 ? 定義 為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)蛋白質(zhì)所采用的一些 DNA分子。 ? 常用載體 質(zhì)粒 DNA 噬菌體 DNA 病毒 DNA ?克隆載體 (cloning vector) 為使插入的外源 DNA序列被 擴(kuò)增 而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體 。 ?表達(dá)載體 (expression vector) 為使插入的外源 DNA序列可 轉(zhuǎn)錄翻譯 成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體。 ?能 自主復(fù)制 ； ?具有兩個以上的 遺傳標(biāo)記 ，便于重組體的篩選和鑒定； ?有 克隆位點(diǎn) （外源 DNA插入點(diǎn)），常具有多個單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)； ?分子量小 ，以容納較大的外源 DNA。 質(zhì)粒 (plasmid) 特點(diǎn) : 能在宿主細(xì)胞內(nèi) 自主復(fù)制 ；帶有某些遺傳信息 , 會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀 。 質(zhì)粒 PGEM3Z ? λ噬菌體 DNA改造系統(tǒng) λgt系列（插入型，適用 cDNA克?。? EMBL系列（置換型，適用基因組克隆） 噬菌體 (phage) ? M13噬菌體 DNA改造系統(tǒng)（含 lacZ基因） M13mp系列 pUC系列 M13噬菌體用途： DNA序列測定； 制備單鏈 DNA探針； 用于定點(diǎn)突變的研究。 粘性質(zhì)粒 (cosmid) 科斯質(zhì)粒 ? 酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) ? 細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) ? 動物病毒 DNA改造的載體 （如腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒） 其他載體 酵母菌人工染色體 基本原理 目的基因的 獲取 DNA導(dǎo)入 受體細(xì)胞 外源基因與載體的 連接 克隆載體的 選擇和構(gòu)建 重組體的 篩選 克隆基因的 表達(dá) 以 質(zhì) 粒 為 載 體 的 DNA 克 隆 過 程 1. 化學(xué)合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。 2. 基因組 DNA文庫 (genomic DNA library) 3. cDNA文庫 (cDNA library) 4. 聚合酶鏈反應(yīng) (PCR) （一）目的基因的獲取 化學(xué)合成法獲取目的基因 由已知氨基酸序列推測可能的 DNA序列。 組織或細(xì)胞染色體 DNA 基因片斷 克隆載體 重組 DNA分子 含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 限制性內(nèi)切酶 受體菌 基因組 DNA文庫 存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組 DNA的集合 ?從基因組 DNA文庫獲取目的基因 限制酶切位點(diǎn) 限制酶消化 除去中間片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色體 DNA 限制酶部分消化 外源 DNA與載體 DNA混合 連接反應(yīng) 體外包裝 用重組噬菌體 感染大腸桿菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文庫 用隨機(jī)切割的真核生物染色體 DNA片段構(gòu)建基因文庫 用目的基因上的一段 DNA做成 探針 與文庫中的 DNA作 核酸雜交 ，從基因文庫中“ 釣出 ”有目的基因的克隆。 mRNA cDNA 雙鏈 cDNA 重組 DNA分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制 ? 從 cDNA文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶 Ⅰ 堿水解 T T T T （二）克隆載體的選擇和構(gòu)建 目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。 （三）外源基因與載體的連接 1. 粘性末端連接 方式： (1)同一限制酶切位點(diǎn)連接 (2)不同限制酶切位點(diǎn)連接 配伍末端連接 非配伍末端連接 Bam HⅠ 切割反應(yīng) GGATCC CCTAGG T4 DNA連接酶 15186。C GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ 切割 GCC TA GGCC