【文章內(nèi)容簡介】 ） 商品化逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種 ① AMV（ 禽成髓細(xì)胞瘤 ） ②McMLV(鼠白血病病毒 )。 31 （ 四 ） 酶的活性 由于尚不完全清楚原因 ， sscDNA能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu) ， 引導(dǎo) Ecoli DNApolⅠ kelnow片段或錄酶合成 cDNA第二條鏈 ， （ 多年來除了自身引導(dǎo)合成 cDNA第二條鏈外別無它法 ） 。 逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶 ， 它的酶活性有： 以 mRNA為模板合成 cDNA DNApol 以 ssDNA為模板 ， 3′－ OHDNA片段為引物 ， 按5′→3′合成 DNA鏈 。 3. RnaseH 外切 RNA酶活性 ， 底物是 RNA－ DNA雜交分子 RNA鏈 ，有兩種： ① 5′→3′外切 RNA， 稱 5′→3′外切 RNA酶； ② 3′→5′外切 RNA酶 ， 稱 3′→5′外切 RNA酶 ， 也稱 RnaseH。 Mn2＋ 存在時 ， 逆轉(zhuǎn)錄酶能切 cccDNA， 此活性 無專一位點 ， 對熱不穩(wěn)定 。 5. DNA解旋酶 類似 unwinding。 32 四 、 DNA聚合酶： DNA聚合酶以 DNA為模板合成 DNA， 基因工程常用的酶有： （ 一 ） 大腸桿菌 DNA聚合酶 Ⅰ （ DNA polⅠ ） 1956年 ， 。 是由 1條多肽鏈組成的球蛋白直徑 65，MW109KD， 并以蛋白敏感的多肽接頭折疊成兩個區(qū)域含 19－ 45％ а螺旋結(jié)構(gòu) ， 分子中有單鏈巰基 ， 每分子含 1個 Zn2＋ 原子 ， 還不能證明 Zn2＋ 參加了催化反應(yīng) ， 酶活性中心有 3個密切相連的結(jié)合位點－即 DNA核模 ， 核苷磷酸 （ 估計引物 ， 生長鏈痘結(jié)合在這里 ） 和dNTP結(jié)合位點 。 1． DNA pol由大小兩亞基組成 ， 具有 3種酶活性 ， 即大亞基 5′→3′DNA聚合酶 ，3′→5′外切酶及小亞基的 5′→3′外切酶活性： （ 1） 5′→3′DNA聚合酶活性 以 ssDNA為模板 ， 沿引物 3′－ OH方向 ， 按模板順序從5′→3′延伸 。 5′CCGATA－ OH DNA polⅠ 5′CCGATAGCCT 3′ 3′GGCTATCGGA5′ Mg2＋ dDNP 3′GGCTCGGA 5′ （ 2） 3′→5′外切酶活性 即從游離的 3′－ OH末端降解 ssDNA或 dsDNA， 其意義在于識別和消除不配對的核酸 ， 保證 DNA復(fù)制的忠實性 。 其 dsDNA外切活性可被 5′→3′聚合活性所抑制 。 5’ CGCATCGOH 3’ DNA polⅠ 5’ CGC 3’ GCG Mg2＋ 3’ GCG ＋ dAdTdCdG 其 dsDNA外切酶活性可被 5′→3′DNA聚合酶活性所抑制 。 （ 3） 5′→3′外切酶活性： 從游離的 5’ 端降解 dsDNA成單核苷酸或寡核苷酸 ， 也降解DNA:RNA雜交體 RNA成分 （ 具有 RnaseH活性 ） 5’ － CTCATTAG－ 3’ DNA polⅠ 5’ － CATTAG 3’ － GCGTAATC－ 5’ Mg2＋ 3’ － GCGTAATC +pC,pG 33 2. DNA polⅠ (DNA polⅠ )在基因工程的應(yīng)用： （ 1） 制備高比活性的探針 DNA polⅠ 可催化 DNA缺口移位反應(yīng) （ Nick translation） ， 為基因工程制備高比活性放射性探針 （ 放標(biāo) ， 非放標(biāo) ，32P， 地高辛 ） 5’ ―――――――― 3’ 3’ ―――――――― 5’ dsDNA Mg2＋ ↓DNA酶 Ⅰ 5’ —3’ （ 3’ —5’ ） ↓32P dNTP,DNA polⅠ （ 全酶 ） 5’ ― 3’ 3’ ― 5’ （ 參缺口平移法圖解 ） （ 2） 用于分子克隆 （ 填充缺口利于重組 ） DNA polⅠ 能填充 DNA的小缺口區(qū) （ Gapped region） →以便有效在體外用于 DNA分子重組 ， 如： ① 切割 cccdsDNA分子作載體時 ② 插入一段不具粘性末端的 DNA片段或加入 1個同源順序 ssDNA片段 ③ 此時用 DNA polⅠ 填充這個缺口 ④ 再用 ligase(3’ OH,P5′)連接 ， 組成重組 DNA分子 。 34 （ 3） DNA序列分析 DNA polⅠ 是 3種測測序法 （ Sanger雙脫氧法 （ 測序自動化原理同 Sauger雙脫氧法 ） ， 化學(xué)降解法和加減法 ） 中的關(guān)鍵試劑 →每個方法的成敗都取決于 DNA polⅠ 從融合引物復(fù)制的 ssDNA的能力 （ 詳參 DNA的序列測定 ） ， 這里僅作簡介 。 ① Sauger雙脫氧法 DNA polⅠ 參入了 2’ 3’ －雙脫氧核苷酸到相應(yīng)的融合了的引物中 ， 從而終止了鏈的進(jìn)一步延伸 ， 這樣每個大小不同片段都帶有 ddNTP。 經(jīng)過PAGE測出 DNA順序 。 ② 化學(xué)降解法 當(dāng) Mg2＋ 被 Mn2＋ 取代時 ， DNA polⅠ 有參與相應(yīng) NTP取代 dNTP的能力 ，參與的這個 NTP可以作為 1個特殊切割位點而被降解 ， 得到帶有 NTP末端的DNA片段 ， 這是化學(xué)法測序的主要原理 。 ③ 加減法 主要原理是在限制使用 dNTP條件下加入 DNA polⅠ 和 T4誘導(dǎo)的 DNA pol同時反應(yīng) 。 在減法反應(yīng)中從 4個反應(yīng)混合物中每 4個 dNTP中減去 1個 。 生長鏈沿著引物延伸至缺少的那個 dNTP為止 。 在加法反應(yīng)中所用的 dNTP只有 1種 ，如 dATP， 通過 DNA pol 3′→5′外切酶活性使鏈終止在帶有 A的 3’ 末端用其它 3種 dNTP進(jìn)行類似反應(yīng) ， 這樣通過加或減法 8個混合物的電泳結(jié)果即可推出 DNA鏈的順序 。 35 （ 二 ） 大腸桿菌 DNA聚合酶 Ⅰ 的大片段－ Klenow片段酶 基因工程很多情況下 ， DNA polⅠ 可用它的 1個大片段Klenow片段酶代替 。 該酶是枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解 DNA polⅠ 所得到的 。 ， MW76KD， 保留了 pol Ⅰ 的 5′→3′DNA聚合酶 ， 3′→5′外切酶活性 。 2. Klenow在基因工程用于： (1)補(bǔ)平用限制酶消化 dsDNA得到的 5’ 粘性末端 （ 即 3’ 延伸末端 ） 5’ － GOH Klenow, Mg2＋ 5’ － GAATT 3’ － CTTAA Dntp 3’ － CTTAA (2)同 （ 1） ， 填平過程中 ， 用 32p dNTP標(biāo)記 DNA片段 3’ 末端 。 (3)cDNA克隆了中 ， 用于合成 cDNA的第二條鏈 。 (4)在 Sanger雙脫氧法 ddNTP系統(tǒng)進(jìn)行序列分析 。 36 （ 三 ） T7噬菌體 DNA聚合酶及測序酶 : 1. T7噬菌體 DNA聚合酶 （ 1） 來源 T7噬菌體感染的 DNApol是兩種蛋白的復(fù)合物 （ T7噬菌體基因蛋白和宿主硫氧還原蛋白的緊密復(fù)合體 ） 。 （ 2） 酶的活性 與 Klenow片段 （ 酶 ） 相似 ， 有 5’ － 3’ 聚合活性以及 3’ － 5’ 外切酶活性 ， 無 5’ － 3’ 外切酶活性 。 ① 5’ － 3’ 聚合活性 其 5’ － 3’ 聚合能力和合成 DNA平均長度較目前已知的其它任何 DNA pol 都強(qiáng) （ 持續(xù)聚合能力強(qiáng) ） 。 可用于拷貝長段模板的引物延伸反應(yīng) 。 ② 3’ － 5’ 外切酶活性 較 Klenow酶強(qiáng) 1000倍 ， 其用途與 Klenow酶一致 ， 不同的是在于可對 3’ 突出端的 DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記 。 2．測序酶 是經(jīng)過基因工程改造的 T7噬菌體 DNA pol，它完全喪失了外切酶的活性，故該酶是 Sanger雙脫氧法對長片段 DNA進(jìn)行序列分析的理想用酶（商品名即測序酶）。 37 （ 四 ） TaqDNA聚合酶 (Taq DNA pol， Taq pol） 該酶是一種耐熱的依賴于 DNA的 DNA聚合酶 ， 具有 5’ － 3’ 聚合活性以及依賴 5’ － 3’ 聚合酶作用的外切酶活性 ， 聚合酶的最適反應(yīng)溫度是 75℃ － 80℃ ,37℃ 活性有 10％ 。 該酶的主要用途是進(jìn)行PCR反應(yīng) （ 詳參聚合酶鏈 ， polymerase chain reaction） 1969年在美國黃石公園溫泉分離出一種嗜熱真菌，即水生棲熱菌株（ thermus aquaticus strain,TYC），該菌能在 70℃ －75℃ 生長，已經(jīng)克隆化該菌的基因， cetus公司首次分離純化了該酶，商品名為 Taq DNA polymerase，分子量 94KD，－ 20℃ 至少可貯存 6個月，由于 Taq DNA polymerase能抵抗鏈分離所需要的高溫（ 94℃ －95℃ ）的反復(fù)處理，故只需在第一次熱變性后，加一次酶，即可以進(jìn)行 30－ 40次循環(huán)，簡化加快了操作程序，實現(xiàn)了 PCR的自動化，耐熱酶還有 VENT、 sac等，以 Taq應(yīng)用最廣。 38 Taq pol主要考慮下述 5個參數(shù) （ PCR） （ 1） 熱穩(wěn)定性 PCR cycle中 ， DNA變性處理通常 30－ 60秒 ，按 30個循環(huán)累計熱變性時間為 15－ 30分鐘 ， Taq pol連續(xù)保溫 30分鐘后 ， 仍保持相對高的活力 。 （ 2） 特異性 退火 （ 復(fù)性 ） 和延伸的溫控對引物模板的轉(zhuǎn)移性影響很大 。 Taq pol最是反應(yīng)溫度是 75℃ 左右 ， 而退火溫度可在 55－70℃ ， 因而 Taq pol可顯著提高引物退火特異性 ， 避免了引物與模板非特異性產(chǎn)物的合成 。 （ 3） 延伸長度 PCR有時需要擴(kuò)增 1kb的片段 ， 這就要求選用DNApol具有較強(qiáng)的延伸能力 。 當(dāng)擴(kuò)增片段 250bp時 ， 使用 Klenow片段時的擴(kuò)增率大為降低 ， 而 Taq pol能從基因組擴(kuò)增 2kb片段 。 39 （ 4） 合成產(chǎn)率高 據(jù)酶反應(yīng)動力規(guī)律 ， 聚合反應(yīng)后期會產(chǎn)生平臺效應(yīng) ，平臺期出現(xiàn)時 ， 合成產(chǎn)物積累多少 ， 直接與 DNA pol的性能有關(guān) 。 用Taq pol平臺期在 25輪循環(huán)時出現(xiàn) ， 產(chǎn)物累計達(dá) 1 107拷貝 ， 高于Klenow片段 。 （ 5） 忠實性 評價一個 DNApol的忠實性在于檢測復(fù)制過程中核苷酸錯誤摻入的頻率 ， 酶的忠實性是一個關(guān)鍵特性 ， 尤其是 PCR擴(kuò)增物進(jìn)行DNA序列分析時就顯得尤為重要 。 Klenow片段錯誤頻率約為 1/10000,Taq pol約為 1/5000， 實際應(yīng)用中 ，Taq pol經(jīng)過 25輪循環(huán)中 ， 延伸產(chǎn)物的任何位點將在 400堿基中出現(xiàn)一個分子篡改原始序列 。 目前已發(fā)現(xiàn) T4DNA pol的忠實性較上二者好 ， 其堿基錯誤摻入頻率107。 現(xiàn)國外已建立 Taq酶克隆菌株 ， 能改進(jìn)上述性能 ， 增加產(chǎn)量 ， 提高產(chǎn)率 。 40 （ 五 ） T4噬菌體 DNA聚合酶 （ T4 DNA pol） 源于 T4噬菌體感染的 。 2. 酶的活性 ， 相似于 Klenow片段 ， 但遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于 Klenow片段 （ 1） 5ˊ→ 3ˊ 聚合活性 （ 2） 3ˊ→ 5ˊ 外切酶活性 （ T4 pol/Klenow） Klenow片段一致 （ 參前 ， 標(biāo)記末端 ， 填平 5’末端 ） ， 不同的是可對 3’ 突出端的 DNA分子進(jìn)行標(biāo)記 。 這是用其強(qiáng)勁的 3ˊ→ 5ˊ 外切酶活性切除 3’ 突出端 ， 產(chǎn)生 3’ 凹端 。 5’ － CTGCCTGCA— 3’ T4DNA pol 5’ － CTG