【正文】 中加入氯霉素時 ） 其拷貝數(shù)猛增至 1000－ 3000之多 ， 該性質(zhì)多基因工程技術(shù)十分有利 。 ③ 分子量小 ， 不具備自傳遞能力 。 ④ 基因工程使用松弛型質(zhì)粒 ， 如含 PBMI復制起點的質(zhì)粒 。 55 2. 抗生素抗性基因 ： （ genotype） 編碼產(chǎn)物 功能 （ phenotype） （ 1） Ampr 酶 水解 β－內(nèi)酰胺環(huán) ， 解除氨芐的毒性 。 （ 2） tetr 1個膜蛋白 可以阻止四環(huán)素進入細胞 。 （ 3） camr 乙酰轉(zhuǎn)乙酶 生成氯霉素羥乙?；苌?， 使之 失去毒性 。 （ 4） neor（ kanr） 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 使 G418（ 長那霉素衍生物 ） 失活 （ 5） hygr 潮霉素 β磷酸轉(zhuǎn)移酶 使潮霉素 β失活 。 56 3. MCS—— 多克隆位點 （ multiple cloining site， MCS） （ 1） MCS 是多個限制酶識別的一段 DNA順序 ， 以便克隆 /插入外源基因 /DNA片段 ， 與之相關(guān)概念有： （ 2） 多聚接頭 （ polyliker） 有些質(zhì)粒載體單一切點少 ， 不能普遍使用 。 為了擴大使用范圍 ， 可以加一段有許多限制酶識別的單一切點的多聚接頭 。 （ 3） 人工接頭 （ linker） 是用若干個 bp組成的 dsDNA片段 ， 一般有一個或以上限制酶識別與切割的順序 。 (2)與 （ 3） 已經(jīng)商品化 ， 注意 liker與 adaptor的區(qū)別 （ 下述 ） 57 4， 啟動子 （ pormoter） （ 1） 概念： ① 促進 DNA轉(zhuǎn)錄的 DNA順序 ， 又稱啟動基因或啟動序列 。 ② 這個 DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游 （ up－stream） ， RNApol結(jié)合在上面 ， 指導酶朝向正確的轉(zhuǎn)錄位置 。 ③ 啟動子又稱啟動基因 ， 是 DNA分子上可以與 RNApol特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位 ， 但啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄 。 ④ DNA分子一個與啟動子基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)的區(qū)域 ， 包括 RNApol識別 ， 結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始 3個功能部位 。 58 （ 2）原核生物啟動子和真核生物啟動子的比較 啟動子功能性質(zhì)： ① 決定轉(zhuǎn)錄方向 ， 啟動啟動下游 （ down－ stream） 基因互補鏈轉(zhuǎn)錄 ， 轉(zhuǎn)錄mRNA與信息鏈一致 。 ② 決定 dsDNA的哪一條鏈作為模板 ， 轉(zhuǎn)錄出 RNA。 ③ 決定轉(zhuǎn)錄效率 ， 強啟動子轉(zhuǎn)錄效率強 ， 弱次之 。 ④ 啟動子是可以接受調(diào)控的 ， 可以被改造的 。 原核生物 40－ 60bp 真核生物啟動子 識別位點 － 35bp（ α2ββσ） TATA因子 （ TFⅡ D） 先結(jié)合 TATAbox， 再結(jié)合RNApol 結(jié)合位點 － 10bp（即 TATA合） － 25bp，富含 AT稱為TATA合或 Hogness合，與 RNApolⅡ 結(jié)合。 起始位點 ＋ 1－＋ 20bp ＋ 1bp， 轉(zhuǎn)錄合成 RNA第一個 bp的位置 （ 同左 ） 59 （ 3）基因工程中常使用強啟動子 表達系統(tǒng) 常用啟動子及備注 1. Ecoli （ 1） Lacuv5（ 乳糖 uv5啟動子 ） （ 2） trp（ 色氨酸啟動子 ） （ 3） Tac（ 乳糖色氨酸雜合啟動子 ） （ 4） λPL（ λphage左向啟動子 ， 包括 CI857ts阻遏子 ） 2. 酵母 （ 1） 己醇脫氨酶啟動子 （ 2） 酸性磷酸酶啟動子 3. 哺乳動物細胞 （ 1） SV40啟動子 （ 帶有增強子 ） (2)腺病毒晚期啟動子 （ 3） Melallothionen基因啟動子 4. 昆蟲細胞 （ 1） 多角蛋白基因啟動子 （ 2） 10K蛋白基因啟動子 5. 植物 （ 1）花葉菜花葉病毒啟動子（ 2） Napalin合成酶啟動子（ 3）微蛋白啟動子。（ Tubulin） 60 用于原核表達系統(tǒng)的強啟動子① Lac→② Lacuv5→③Trp→④ Tac→⑤ λPL→⑥ T7 名 稱 來 源 組 成 正 調(diào) 控 負 調(diào) 控 備 注 1． Lac （ 1） Pg（啟動基因）；（ 2） CAP（降解物激活蛋白基因）；（ 3） O（操縱子）；（ 4） S（部分 β－半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)基因）。 分解代謝系統(tǒng)： CAP－cAMP－ 激活 P （啟動子 ）－ 促進轉(zhuǎn)錄 阻遏物－ R調(diào)節(jié)基因 R編碼產(chǎn)物產(chǎn)生阻遏蛋白－ 結(jié)合在 O上 （ 操縱基因 ） －阻止轉(zhuǎn)錄 存在乳糖時－ 乳糖－ 結(jié)合阻遏蛋白－ 解除對轉(zhuǎn)錄阻遏－ 開始轉(zhuǎn)錄 2 ． L a c －uv5 是一個突變?nèi)樘遣倏v子 I P I G 是 β－半乳糖苷酶底物類似物－ 它能與阻遏蛋白結(jié) 合 － 使 O 成游離狀態(tài) 對分解代謝抑制不敏感－ 即使沒有 CAP－cAMP－ 轉(zhuǎn)錄照常進行 據(jù)報首 Lac組建載體在原核細胞表達時IPTG可提高真核基因表達水平 50倍。 61 名稱 來源 組成 正調(diào)控 負調(diào)控 備注 3． Trp 從 氨酸操縱子分離 （ 1） Pg（ 啟動基因 ） ；（ 2） R（ 制動基因 ） ；（ 3） O（ 操縱基因 ） ；（ 4） SE（ 色氨酸 Trp部分結(jié)構(gòu)基因 ） 。 β－吲哚丙烯酸是 Trp的競爭性抑制劑－ 它能與阻遏蛋白結(jié)合－ 阻止了Trp與之結(jié)合而活化－ 使轉(zhuǎn)錄進行 調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生阻遏蛋白，結(jié)合 Trp有活性－ 再結(jié)合在 O上阻止轉(zhuǎn)錄－缺乏 Trp－ 阻遏蛋白不能活化－ 去阻遏 據(jù)報道 β－吲哚丙烯酸在轉(zhuǎn)錄水平至少可以增強 50倍 ↑，另外制動基因缺乏可提高轉(zhuǎn)錄水平 ↑8－ 10倍 4． Tac（ T r p－ L a c ） 人工構(gòu)建的Trp＋ La c雜合啟動子 （ 1） tacⅠ =Trp 35+ Lac－ uv520； （ 2） tacⅡ ＝ Trp35＋一個合成的 46bp片段；包括 p rib row合和LacO（ 3） tac12＝ Trp－ 35＋ Lac－ 10區(qū) ， 操縱基因 O部分 ， SD順序融合而成 。 IPIG誘導 受 Lac阻遏物的調(diào)控 （ 1） 比 Lacuv5強 7 倍； （ 2 ）受體菌有 RB791，XL－ b l u e ，SB221， JM109等 。 5 。 T 7噬菌體啟動子 帶有 Lacuv5啟動子控制的 T 7 噬菌體 RNA pol基因 IPIG誘導 （ 1） 比 Lacuv5強 7 倍； （ 2 ）受體菌有 RB791，XL－ b l u e ，SB221， JM109等 。 62 /沉默子 （ enhancer， E/silencer（ negatire enhancer） （ 1） 概念 為真核基因組 （ 包括真核病毒基因組 ） 中的一種具有增強鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序 。 其作用與增強子所在的位置或方向無關(guān) 。 即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用 。 /沉默子－負增強子 ， 負調(diào)控序列 。 （ 2） 增強子的作用特點 ① 可在基因的 5’ 或 3’ 端發(fā)揮作用 ， 一般在 5’ 端轉(zhuǎn)錄起始點上游－ 100至－ 300bp處 。 ② 不受序列方向制約； ③ 通過增強啟動子發(fā)揮作用 。 （ 3） 增強子的作用機制： ① 改變 DNA的螺旋結(jié)構(gòu) ， 使其成柔曲線－ 拉近 E/P距離； ② 為 DNA模板提供某一特定空間微環(huán)境－ 促進 top異構(gòu)酶改變DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)； ③ 為 RNA pol和反式作用因子提供一個與順式元件聯(lián)系的結(jié)構(gòu) 。如增強子的荃環(huán)利于與反式因子結(jié)合 。 63 6. 核糖體結(jié)合位點 /起始密碼 /SD序列 （ Rbs/AGU/SDs） mRNA有核糖體的兩個結(jié)合位點 ， 對于原核而言是 AUG（ 起始密碼 ） 和 SD序列 （ 位于 AUG上游 3－ 11bp處由 3－ 9bp組成的序列 。 這段序列富含嘌呤核苷酸 ， 剛好與 16sRNA富含嘧啶的序列互補 ， 是 RNA識別和結(jié)合的位點 。 由于 － L Dagarne（ 1974） 首先發(fā)現(xiàn) ， 故名 。 mRNA 5’ AGGAGG－ UUGACCU－ AUG 3’ AUCCUCC－ UAG, rRNA的 3’ 末端 （ 1） 翻譯水平的調(diào)控是不嚴格的 ， 只有 mRNA/Rbs結(jié)合才是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵 。 （ Rbs是 ） 。 （ 2） 不同的啟動子表達一種 ， SD－ AUG之間的距離可能是不一樣的 ， 在試圖提高表達效率 ， SD－ AUG之間的距離是重視的因素之一 。 64 7． 轉(zhuǎn)錄終止順序 （ 終止子 ） /翻譯終止密碼子 （ terminator o transcrition，term terminator of translation, terminator codon,stop codon） ： （ 1） 轉(zhuǎn)錄終止子 /term 指一個基因編碼區(qū) down stream的 DNA順序 ，可被 RNA pol識別為停止合成 mRNA的信號 。 原核生物中 ， 在轉(zhuǎn)錄部分末端 term常有一個 IR和緊接著的一小段 ， 基因轉(zhuǎn)錄部分之外可能還有影響轉(zhuǎn)錄終止的順序 。 值得注意的是： ① 有些載體不含終止序列 ， 表達外源蛋白質(zhì)時也可獲得較滿意的結(jié)果（ 基因轉(zhuǎn)錄之外順序可影響轉(zhuǎn)錄終止 ） ； ② 多數(shù)外源蛋白質(zhì)表達載體帶有合適的終止順序； ③ 轉(zhuǎn)錄終止順序有長有短 ， 短的長約 700－ 800bp。 （ 2） 翻譯終止密碼子 /terminator codon mRNA種三個核苷酸順序可終止蛋白質(zhì)的合成 ， 有 3種終止碼：UAA（ 赫石型 ） UAG（ 琥珀型 ） 和 UAG（ 空白型 ） （ 參 nonsense mutation supperessor。 ） 65 8． 加 poly（ A） 尾信號 結(jié)構(gòu)基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA的保守序列 ， 此位點 down－ stream有一段 GT或 T富豐區(qū) ， 這 2部分共同構(gòu)成 poly（ A）加尾信號 。 mRNA轉(zhuǎn)錄到此后 ， 產(chǎn)生 AAUAAA和隨后的 GU或 U豐富區(qū) ， 與RNApol結(jié)合的延長因子 ， 可以識別這種結(jié)構(gòu)并與之結(jié)合 ， 然后在AAUAAA下游 10－ 30bp的部位切斷 RNA， 并加上 poly（ A） 尾 。 關(guān)于 7和 8， 至今 ， 對真核轉(zhuǎn)錄終止信號 /終止機制了解不多 ,主要困難是難以確定原初轉(zhuǎn)錄物的 3’ 末端 ， 因為大多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄后很快進行加工 。 現(xiàn)在基因工程表達載體使用的轉(zhuǎn)錄終止子都是病毒基因或細胞基因 3’ 端的一段序列 ， 其中包括 3’ 不翻譯區(qū) ， 終止位點和 poly(A)位點 （ 整段照搬 ） 。 66 第四節(jié) 重組 DNA技術(shù)的基本過程 基因工程包括 3個步驟： 1． DNA重組 2． 重組 DNA導入宿主細胞－克隆擴增或表達 3． 基因工程的后處理 （ down－ stream techniques of GE） 重組 DNA技術(shù)的基本過程： 1． 載體的選擇和制備 —— 分； 2． 制備目的基因片段 —— 切； 3． DNA片段的重組連接 —— 接； 4． 重組 DNA導入受體細胞 —— 轉(zhuǎn)； 5． 轉(zhuǎn)化子的篩選 —— 篩； 6． 重組子的篩選 —— 篩； 7． 重組子的鑒定 —— 鑒； 8． 克隆擴增或表達 —— 擴 /表達； 9． 基因工程的后處理 —— 分 。 67 (xbal I) EcoRI EcoRI (Hind III) PUC