freepeople性欧美熟妇, 色戒完整版无删减158分钟hd, 无码精品国产vα在线观看DVD, 丰满少妇伦精品无码专区在线观看,艾栗栗与纹身男宾馆3p50分钟,国产AV片在线观看,黑人与美女高潮,18岁女RAPPERDISSSUBS,国产手机在机看影片

正文內(nèi)容

8第八章基因工程1(2)(參考版)

2025-02-23 11:20本頁面
  

【正文】 67 (xbal I) EcoRI EcoRI (Hind III) PUC
。 現(xiàn)在基因工程表達載體使用的轉(zhuǎn)錄終止子都是病毒基因或細胞基因 3’ 端的一段序列 , 其中包括 3’ 不翻譯區(qū) , 終止位點和 poly(A)位點 ( 整段照搬 ) 。 mRNA轉(zhuǎn)錄到此后 , 產(chǎn)生 AAUAAA和隨后的 GU或 U豐富區(qū) , 與RNApol結合的延長因子 , 可以識別這種結構并與之結合 , 然后在AAUAAA下游 10- 30bp的部位切斷 RNA, 并加上 poly( A) 尾 。 ( 2) 翻譯終止密碼子 /terminator codon mRNA種三個核苷酸順序可終止蛋白質(zhì)的合成 , 有 3種終止碼:UAA( 赫石型 ) UAG( 琥珀型 ) 和 UAG( 空白型 ) ( 參 nonsense mutation supperessor。 原核生物中 , 在轉(zhuǎn)錄部分末端 term常有一個 IR和緊接著的一小段 , 基因轉(zhuǎn)錄部分之外可能還有影響轉(zhuǎn)錄終止的順序 。 ( 2) 不同的啟動子表達一種 , SD- AUG之間的距離可能是不一樣的 , 在試圖提高表達效率 , SD- AUG之間的距離是重視的因素之一 。 mRNA 5’ AGGAGG- UUGACCU- AUG 3’ AUCCUCC- UAG, rRNA的 3’ 末端 ( 1) 翻譯水平的調(diào)控是不嚴格的 , 只有 mRNA/Rbs結合才是蛋白質(zhì)合成的關鍵 。 這段序列富含嘌呤核苷酸 , 剛好與 16sRNA富含嘧啶的序列互補 , 是 RNA識別和結合的位點 。如增強子的荃環(huán)利于與反式因子結合 。 ② 不受序列方向制約; ③ 通過增強啟動子發(fā)揮作用 。 /沉默子-負增強子 , 負調(diào)控序列 。 其作用與增強子所在的位置或方向無關 。 T 7噬菌體啟動子 帶有 Lacuv5啟動子控制的 T 7 噬菌體 RNA pol基因 IPIG誘導 ( 1) 比 Lacuv5強 7 倍; ( 2 )受體菌有 RB791,XL- b l u e ,SB221, JM109等 。 IPIG誘導 受 Lac阻遏物的調(diào)控 ( 1) 比 Lacuv5強 7 倍; ( 2 )受體菌有 RB791,XL- b l u e ,SB221, JM109等 。 61 名稱 來源 組成 正調(diào)控 負調(diào)控 備注 3. Trp 從 氨酸操縱子分離 ( 1) Pg( 啟動基因 ) ;( 2) R( 制動基因 ) ;( 3) O( 操縱基因 ) ;( 4) SE( 色氨酸 Trp部分結構基因 ) 。( Tubulin) 60 用于原核表達系統(tǒng)的強啟動子① Lac→② Lacuv5→③Trp→④ Tac→⑤ λPL→⑥ T7 名 稱 來 源 組 成 正 調(diào) 控 負 調(diào) 控 備 注 1. Lac ( 1) Pg(啟動基因);( 2) CAP(降解物激活蛋白基因);( 3) O(操縱子);( 4) S(部分 β-半乳糖苷酶結構基因)。 原核生物 40- 60bp 真核生物啟動子 識別位點 - 35bp( α2ββσ) TATA因子 ( TFⅡ D) 先結合 TATAbox, 再結合RNApol 結合位點 - 10bp(即 TATA合) - 25bp,富含 AT稱為TATA合或 Hogness合,與 RNApolⅡ 結合。 ③ 決定轉(zhuǎn)錄效率 , 強啟動子轉(zhuǎn)錄效率強 , 弱次之 。 58 ( 2)原核生物啟動子和真核生物啟動子的比較 啟動子功能性質(zhì): ① 決定轉(zhuǎn)錄方向 , 啟動啟動下游 ( down- stream) 基因互補鏈轉(zhuǎn)錄 , 轉(zhuǎn)錄mRNA與信息鏈一致 。 ③ 啟動子又稱啟動基因 , 是 DNA分子上可以與 RNApol特異性結合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位 , 但啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄 。 (2)與 ( 3) 已經(jīng)商品化 , 注意 liker與 adaptor的區(qū)別 ( 下述 ) 57 4, 啟動子 ( pormoter) ( 1) 概念: ① 促進 DNA轉(zhuǎn)錄的 DNA順序 , 又稱啟動基因或啟動序列 。 為了擴大使用范圍 , 可以加一段有許多限制酶識別的單一切點的多聚接頭 。 ( 4) neor( kanr) 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 使 G418( 長那霉素衍生物 ) 失活 ( 5) hygr 潮霉素 β磷酸轉(zhuǎn)移酶 使潮霉素 β失活 。 ( 2) tetr 1個膜蛋白 可以阻止四環(huán)素進入細胞 。 ④ 基因工程使用松弛型質(zhì)粒 , 如含 PBMI復制起點的質(zhì)粒 。 ② 復制不受宿主細菌復制系統(tǒng)的限制 , 僅需 DDDPI, 當宿主蛋白 質(zhì)合成受到抑制 ( 如培養(yǎng)中加入氯霉素時 ) 其拷貝數(shù)猛增至 1000- 3000之多 , 該性質(zhì)多基因工程技術十分有利 。 復制子 是一段包括復制起始位點 , 反式因子作用在內(nèi)的 DNA片段 , 其功能是通過復制使質(zhì)粒能穩(wěn)定存在宿主菌內(nèi) ( 如 ) 。 ( 4) 穿梭質(zhì)粒含原核和真核生物 2個復制子 , 以確保兩類細胞中都能擴增 。 ( 2) 使繁殖后細胞維持一定量的拷貝數(shù) 。 (4)載體本身及其元件的質(zhì)量 不能搞成 “ 豆腐渣工程 ” , 如 P要 “ 強大陣容 ” 。 ) 53 ( 三 ) 元件的類別和質(zhì)量 : 基因工程前考慮的 4個問題: (1)基因工程的目的 克隆擴增 /表達 :① 生產(chǎn)產(chǎn)品 ② 基因治療 (2)克隆片段的大小運載多大重量的車子 。 這樣一個基因表達需要的具有表達和調(diào)控能力的載體稱表達載體 。 ( Expression vector) 具有克隆載體的基本元件 ( ori,Ampr,Mcs等 ) 還具有轉(zhuǎn)錄 /翻譯所必需的 DNA順序的載體 。 ( 一 ) 概念: ( cloning vector) 都有一個松弛的復制子 , 能帶動外源基因 , 在宿主細胞中復制擴增 。 51 四 、 克隆載體和表達載體 : 所有的載體可以分成兩大類:克隆載體和表達載體 。 ( 二 ) 都能便利的加以檢測 如載體的藥物抗性基因 , 多是抗生素抗性基因 , 將受體細胞放在含有該抗生素培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長時 , 只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細胞才能存活 。 細菌人工染色體 。 DNA分子 , 可以插入或克隆 DNA片段統(tǒng)稱為 vector。 45 幾種重要的工具酶的酶學性質(zhì)及在基因工程中的應用 酶 來源 活性 底物 輔因子 特點 用途 ( Ⅱ )( r e s t r i c t i o n endonuclease,restrction enzymes) 微生物 400RE/350M 內(nèi)切 dsDNA Mg2+ 特異性識別和切割dsDNA,產(chǎn)生平頭或粘性( 5’3’)末端 1. DNA重組2 . 組建新質(zhì)粒 3 . 構建物理圖譜 4 . 制備探針5 . DNA序列分析 6 . 分子雜交 2. 連接酶( ligase) T4phage 連接兩個片段 dsDNA Mg2+ ATP 活力:粘端 平端 1. DNA重組分析 3. DNA聚合酶 Ⅰ( DNA polⅠ ) 5’- 3’聚合;3’5’外切; 5’3’外切 ssDNA dsDNA dsDNA ssDNA Mg2+ 對 d s D N A外切活性可被 5’- 3’pol活性所 1 . 制備探針2 . DNA序列分析 46 酶 來源 活性 底物 輔因子 特點 用途 4 . 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶( Reverse Transcription) RNA腫瘤病毒 RNA→cDNA; DNA→DNA RNAseH解旋 ssRNA ssDNA RNA:DNA cccDNA Mg2+ RNA指導 DNA指導 解超螺旋 制備 cDNA 5 . SI核酸酶( Nase SI) 米曲霉 切單鏈 ssDNA ssRNA Zn2+ 切除單鏈 切尾巴 , 產(chǎn)生平端 , 用于質(zhì)粒組建和 DNA重組 6. Bal31 乳白短桿菌 外切 dsDNA Ca2+ 5’3’兩端同時籌速外切 7. 末端轉(zhuǎn)移酶( TTE) 小牛胸腺 加 d N T P 到DNA分子 3’-OH末端 dsDNA or ssDNA3’OH Mg2+ Co2+ 存在可具有延伸 3’- OH的DNA為模板 造成人工粘端 , 便于重組; 32p標記DNA分子 3’末端 8. BIP/CIP 細菌 /牛腸 切除磷酸 ds,ss Ca2+ Mg2+ 阻斷片段或載體自身環(huán)化。 (二)去除 5ˊ P,防止 DNA片段或載體自身環(huán)化。 44 七、堿性磷酸酶( alkaline phoptase, APE) APE包括 BAP(細菌堿性磷酶和 CIP(小腸堿性磷酶)。 ( 三 ) 酶活性: 1. 催化一個單核酸 ( dNTP) - 加到另一個 DNA分子的 3’ - OH末端 ,如: ssDNA- OH TTE, Mg2+ 或 Mn2+ DNA- pd( N) n+ ppi ndNTP 2. 平端或帶延伸 3’ - OH末端的 dsDNA需要 Co2+ 存在才能作模板 , 如: dsDNA TTE Co2+ DNA- pd( N) n+ nppi ndNTP ( 四 ) 基因工程中用于: 1. 加一個互補同源多聚尾- 到載體和 cDNA- 造成便于重組的人工粘性末端 。 是僅存于前淋巴細胞及淋巴樣細胞內(nèi)的一種不同尋常的 DNApol, 催化 dNTP加到 DNA分子 3’ - OH末端 , 也稱末端脫氧核苷酰 ( 酸 ) 轉(zhuǎn)移酶 ( terminal transferase, TTE) 。 ( 3)確定 DNA的二級結構 →如 z- DNA與 bDNA的結合部位等。 4. 基因工程用于: ( 1) 通過可控方式去除 dsDNA末端的核苷酸 →用于基因克隆表達 、 缺失突變等 。 3. ( 1) 3’ 外切核酸酶活性:底物平端 dsDNA或 dsDNA切口; 3’- OH突出端或 ssDNA; dsRNA。 42 (二 )BAL31核酸 ( 源于乳白短桿菌 ) 乳白短桿菌 。 ② 打開 cDNA中的發(fā)夾環(huán) , 使其成平端 。 、 中 、 極高 3種情況變化- (1)降解 ssDNA或 ssRNA形成 5’ p末端的單或寡核苷酸 , 對 DNA活性強于 RNA,如: ssDNA或 ssRNA SI, PH4,5 Zn2+ 5ˊpdN 或 5ˊprN (2)中量 SI可從切口 ( Nick) 或小缺口 ( small gaps) 處降解 dsDNA, (3)極大量的 SI才能講解 dsDNA或 DNARNA雜交鏈 , 原因是后者對SI講解有抗性 , 所以 SI又稱單鏈特異的核酸酶 。 5’ - CTGCCTGCA— 3’ T4DNA pol 5’ - CTG 5’ CTACC 3’ GACGG 32PdCtp,dNtp 3’ - GACGG 3’ GACGG 41 五 . 核酸酶 常用的的單鏈特異的 SI核酸酶 ( 核酸酶 SI,nuclease SI, SI) 和 BAL31。 2. 酶的活性 , 相似于 Klenow片段 , 但遠遠強于 Klenow片段 ( 1) 5ˊ→ 3ˊ 聚合活性
點擊復制文檔內(nèi)容
黨政相關相關推薦
文庫吧 www.dybbs8.com
備案圖鄂ICP備17016276號-1