【正文】 （ 2） 3ˊ→ 5ˊ 外切酶活性 （ T4 pol/Klenow） Klenow片段一致 （ 參前 ， 標記末端 ， 填平 5’末端 ） ， 不同的是可對 3’ 突出端的 DNA分子進行標記 。 現(xiàn)國外已建立 Taq酶克隆菌株 ， 能改進上述性能 ， 增加產(chǎn)量 ， 提高產(chǎn)率 。 Klenow片段錯誤頻率約為 1/10000,Taq pol約為 1/5000， 實際應用中 ，Taq pol經(jīng)過 25輪循環(huán)中 ， 延伸產(chǎn)物的任何位點將在 400堿基中出現(xiàn)一個分子篡改原始序列 。 用Taq pol平臺期在 25輪循環(huán)時出現(xiàn) ， 產(chǎn)物累計達 1 107拷貝 ， 高于Klenow片段 。 當擴增片段 250bp時 ， 使用 Klenow片段時的擴增率大為降低 ， 而 Taq pol能從基因組擴增 2kb片段 。 Taq pol最是反應溫度是 75℃ 左右 ， 而退火溫度可在 55－70℃ ， 因而 Taq pol可顯著提高引物退火特異性 ， 避免了引物與模板非特異性產(chǎn)物的合成 。 38 Taq pol主要考慮下述 5個參數(shù) （ PCR） （ 1） 熱穩(wěn)定性 PCR cycle中 ， DNA變性處理通常 30－ 60秒 ，按 30個循環(huán)累計熱變性時間為 15－ 30分鐘 ， Taq pol連續(xù)保溫 30分鐘后 ， 仍保持相對高的活力 。 37 （ 四 ） TaqDNA聚合酶 (Taq DNA pol， Taq pol） 該酶是一種耐熱的依賴于 DNA的 DNA聚合酶 ， 具有 5’ － 3’ 聚合活性以及依賴 5’ － 3’ 聚合酶作用的外切酶活性 ， 聚合酶的最適反應溫度是 75℃ － 80℃ ,37℃ 活性有 10％ 。 ② 3’ － 5’ 外切酶活性 較 Klenow酶強 1000倍 ， 其用途與 Klenow酶一致 ， 不同的是在于可對 3’ 突出端的 DNA分子進行末端標記 。 ① 5’ － 3’ 聚合活性 其 5’ － 3’ 聚合能力和合成 DNA平均長度較目前已知的其它任何 DNA pol 都強 （ 持續(xù)聚合能力強 ） 。 36 （ 三 ） T7噬菌體 DNA聚合酶及測序酶 : 1. T7噬菌體 DNA聚合酶 （ 1） 來源 T7噬菌體感染的 DNApol是兩種蛋白的復合物 （ T7噬菌體基因蛋白和宿主硫氧還原蛋白的緊密復合體 ） 。 (3)cDNA克隆了中 ， 用于合成 cDNA的第二條鏈 。 ， MW76KD， 保留了 pol Ⅰ 的 5′→3′DNA聚合酶 ， 3′→5′外切酶活性 。 35 （ 二 ） 大腸桿菌 DNA聚合酶 Ⅰ 的大片段－ Klenow片段酶 基因工程很多情況下 ， DNA polⅠ 可用它的 1個大片段Klenow片段酶代替 。 生長鏈沿著引物延伸至缺少的那個 dNTP為止 。 ③ 加減法 主要原理是在限制使用 dNTP條件下加入 DNA polⅠ 和 T4誘導的 DNA pol同時反應 。 經(jīng)過PAGE測出 DNA順序 。 34 （ 3） DNA序列分析 DNA polⅠ 是 3種測測序法 （ Sanger雙脫氧法 （ 測序自動化原理同 Sauger雙脫氧法 ） ， 化學降解法和加減法 ） 中的關鍵試劑 →每個方法的成敗都取決于 DNA polⅠ 從融合引物復制的 ssDNA的能力 （ 詳參 DNA的序列測定 ） ， 這里僅作簡介 。 5’ CGCATCGOH 3’ DNA polⅠ 5’ CGC 3’ GCG Mg2＋ 3’ GCG ＋ dAdTdCdG 其 dsDNA外切酶活性可被 5′→3′DNA聚合酶活性所抑制 。 5′CCGATA－ OH DNA polⅠ 5′CCGATAGCCT 3′ 3′GGCTATCGGA5′ Mg2＋ dDNP 3′GGCTCGGA 5′ （ 2） 3′→5′外切酶活性 即從游離的 3′－ OH末端降解 ssDNA或 dsDNA， 其意義在于識別和消除不配對的核酸 ， 保證 DNA復制的忠實性 。 是由 1條多肽鏈組成的球蛋白直徑 65，MW109KD， 并以蛋白敏感的多肽接頭折疊成兩個區(qū)域含 19－ 45％ а螺旋結(jié)構 ， 分子中有單鏈巰基 ， 每分子含 1個 Zn2＋ 原子 ， 還不能證明 Zn2＋ 參加了催化反應 ， 酶活性中心有 3個密切相連的結(jié)合位點－即 DNA核模 ， 核苷磷酸 （ 估計引物 ， 生長鏈痘結(jié)合在這里 ） 和dNTP結(jié)合位點 。 5. DNA解旋酶 類似 unwinding。 3. RnaseH 外切 RNA酶活性 ， 底物是 RNA－ DNA雜交分子 RNA鏈 ，有兩種： ① 5′→3′外切 RNA， 稱 5′→3′外切 RNA酶； ② 3′→5′外切 RNA酶 ， 稱 3′→5′外切 RNA酶 ， 也稱 RnaseH。 31 （ 四 ） 酶的活性 由于尚不完全清楚原因 ， sscDNA能形成發(fā)夾結(jié)構 ， 引導 Ecoli DNApolⅠ kelnow片段或錄酶合成 cDNA第二條鏈 ， （ 多年來除了自身引導合成 cDNA第二條鏈外別無它法 ） 。 （ 二 ） 功能 基因工程中主要用于逆轉(zhuǎn)錄 mRNA→cDNA（ plementory DNA） 。 是由Baltimove從鼠白血病病毒 （ murine leukemia virus,MLV） 和Mizutan從勞氏肉瘤病毒 (Rous sara virus,RSV)中 ， 于1970年分別各自發(fā)現(xiàn)的 ， 這兩個小組論文同時在同一期Nature上 ， 可見其意義 。 （ 三 ） 催化反應： （ 1） 需要 ATP、 Mg2+作輔助因子； （ 2） 缺刻 （ Nick） DNA也可作該酶的底物 。 29 二 ． DNA連接酶： DNA連接酶是基因工程第二位重要的工具酶 ， 常用 T4DNA ligase. （ 一 ） 功能： 催化有互補順序的兩個 dsDNA分子的粘性末端或平頭末端 3′－ OH、 5′－ P連接作用 。 （ 六 ） 限制酶的應用： 1． DNA重組 DNA 序列分析 DNA指針 ,DNA 新質(zhì)粒 28 DNA物理圖譜 —— 標明限制酶在 DNA分子上的限制位點數(shù) ， 限制性片段的大小及排列順序的圖譜稱之或稱限制性圖譜 。 對于限制反應機制 ， 盡管書上列出 1，2步反應 ， 但人們更關注他的應用 。 27 (五 )限制酶得正常識別切割能力是 buffer的或幾個因子的函數(shù) （ 1－ 8等 ） 度 、 純度 ： Mg2+、 Mn2+、 Co2+、 Zn2＋ ：甘油 、DMSO、 甲酰胺 Polisky證明 ， Mgcl2從 5mM下降至 2mM， pH值上升到 ， EcoRI專一性從 6bp下降至 4bp即 NAATN,這種識別 AATT的 EcoRI稱 EcoRI*。 3． 同尾酶 （ isoaudumers識別順序不同 ， 產(chǎn)生粘性末端相同的酶稱之 。 如： HpaⅡ →CCGG MspⅠ →CCG*G MboⅠ →GATC Sau 3A→GA*TC （ 稱 subsets識別與切割相互有關的酶稱之 。 26 （四） 同裂酶 (isoschizomers) 通常不同的酶識別不同的順序 ， 然而有許多不同源限制酶產(chǎn)生相同的末端 ， 此即同裂酶 。 ， 但二者距離是一定的 (某些酶識別位點在切割位點附近 ),即產(chǎn)生特定的 DNA片段 ， 這是與 Ⅰ 型酶的區(qū)別之一 。 簡并序列 是指序列中有核苷酸位可以是不同的核苷酸 。 若 DNA堿基組成是均一的 ， 限制酶切點是隨機的 ， 那么對于： ① 要求 4bp靶序列如 HpaⅡ,MboⅠ 等在龐大 DNA鏈上平均 44核苷酸即可遇到一個靶序列 ， 即 1/256 ② 同理 ， 要求 6bp的酶 ， 則平均 46遇到一個靶序列 ， 即1/4096。 （ 3） 識別順序呈二重對稱 ， 即 1800旋轉(zhuǎn)對稱 。 （ 2） 它能 識別 dsDNA的 4－ 6bp的回文序列并水解該部分的核苷鍵 。 第一個字母大寫 該微生物屬名前的第一個字母 第二 、 三個字母小寫 該微生物種名前的 2個字母 第四個字母大寫 有變種或品系的第一個字母 羅馬字母 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 從一種微生物中發(fā)現(xiàn)了幾種限 制酶 ， 按發(fā)現(xiàn)順序排列 如 EcoRⅠ 是指從大腸桿菌 （ Escherichia coli） R株分離得到的第一種限制酶 。 Ⅱ 型酶分子量小 ， 僅需 Mg2＋ 作為催化反應的輔因子 ， 識別與切割位點相同 ， 產(chǎn)生特異的 DNA片段 。 （ 1） Ⅰ 、 Ⅲ 型 ， 兼具限制與修飾活性 ， 它們識別與切割順序不在一個地方 ， 不產(chǎn)生特異性的 DNA片段 ， 與基因工程意義不大 （ 有說 Ⅲ 型識別核切割的位點一致 ， 但罕見 ） 。 所謂限制 （ restriction） =切割 （ clearage） =水解 （ hydrolysis） 該部位的核苷鍵 （ 磷酸二酯鍵 ） 限制酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的 （ 400多種 E/350M） 。 21 一 ． 限制性核酸內(nèi)切酶 （ 一 ） 限制酶的概念 （ 定義 ， 分類 ， 命名 ， 限制與修飾辨正關系 ） 限制酶 （ restriction endonuclease,restrction enzymes）是一類專門切割 DNA的酶 ， 它們能特異結(jié)合一段被稱為限制酶識別順序的特殊 DNA序列 。 2．發(fā)酵工程 3． 酶學工程 4． 細胞工程 5． 農(nóng)業(yè)工程 6． 希望工程 20 第二節(jié) 工 具 酶 常用的工具酶（ tool enzymes）有 ： （ resriction enzymes,restriction endonadease) （ DNA ligase,ligase) (reverse transcriptase) (DNA polymerase,DNA pol) (nuclease) (terminal transferase) (BAP或 CIP) 以 1. 和 2. 最為常用，最為重要。 （ 1） 基因工程： ① DNA重組； ② DNA體外誘變； ③ 體外基因操作； ④ 基因化學合成等 。 基因工程包括 DNA重組技術 ， 現(xiàn)將相關的概念關系列表如下 。 （ 2） 作為動詞 ， 是 “ 去克隆 ” ， 即利用體外 DNA重組技術將一個特定的基因或 DNA順序插入一個載體分子 。 ② 基因型 （ geype） 相同的細胞或生物體的一個群體 。 由于整個操作在分子水平上進行 ， 所以稱為分子克隆（ molecular cloning） 。 ， 引入適當?shù)乃拗骷毎腥?。 有了這些理論核技術的武裝 ， 基因工程的臨盆降生指日可待 ， Berg和 Cohen兩位科學的 “ 助產(chǎn)士 ” ， 把基因工程接到了人間 。 （ 2） 即使有了基因圖譜 ， 因為真核基因有內(nèi)含子 ， 不能在原核表達系統(tǒng)剪接出 mRNA， 沒有成熟的 mRNA就不能得到相應得產(chǎn)物 。 （ 原因如下 ） ( 1 )真核基因組龐大而復雜 ， 不易制得基因圖譜 。 這是基因工程的第二個技術準備 。 （ 2） 1946年起 ， Lederberg就研究細菌性因子 （ F因子 ） .5060年代相繼發(fā)現(xiàn)了 R因子 （ 抗藥因子 ） ，CoE(大腸桿菌因子 )等質(zhì)粒 。 （ 3） 1970年 ， Smith和 Wilcox在流感嗜血桿菌（ Haemophilus inffuenzae） 分離純化了 HindⅡ ， 取得了突破 ， 打破了基因工程的禁錮 ， 迎來了改造生物的春天 ， 為基因工程奠定了最為重要的技術基