【文章內(nèi)容簡介】 有一些同裂酶對于切割位點上的甲基化堿基的敏感性有所差別，所以可以用來研究 DNA甲基化作用。KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG 有一些 來源不同 的限制性酶識別的是 相同的核苷酸靶序列 ，這類酶稱為同裂酶。216。 用途 如：限制酶 HpaⅡ 和 MspⅠ 是一對同裂酶，共同的靶序列是 CCGG。當其靶序列中含有一個 5甲基胞嘧啶（ CCGG，*號表示甲基化的堿基）， HpaⅡ 不能夠切割它，而 MspⅠ 對于這個核苷酸的甲基化作用的反應則是中性的，它不管 C殘基甲基化與否都能夠切割之。* 現(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)，許多動物 DNA中 90%以上的甲基，都是在序列 CG處以 5甲基胞嘧啶的形式出現(xiàn)。所以，通過比較HpaⅡ 和 MspⅠ 的 DNA消化產(chǎn)物就可以檢測出甲基化的存在。同尾酶（ isocaudamer）216。 概念 常用的限制酶 BamHⅠ 、 BacⅡ 、 BglⅡ 、 Sau3AⅠ和 XhoⅡ 就是一組同尾酶，它們切割 DNA后都形成由GATC 4個核苷酸組成的粘性末端。216。 舉例 與同裂酶對應的一類限制性酶，它們雖然 來源各異 ，識別的 靶序列也各不相同 ，但都產(chǎn)生出 相同的粘性末端 ，這類酶稱為同尾酶。BamH I 5180。 ... G^G A T C C ... 3180。 3180。 ... C C T A G^G ... 5180。 Bgl II5180。 ... A^G A T C T ... 3180。 3180。 ... T C T A G^A ... 5180。 Sau3A5180。 ... ^G A T C ... 3180。 3180。 ... C T A G^ ... 5180。 216。 用途 由于同尾酶切割 DNA后產(chǎn)生的是粘性末端，因此，可以通過粘性末端之間的互補作用而彼此連接起來，這在基因克隆實驗中是很有用處的。167。 由 一對同尾酶 分別產(chǎn)生的 粘性末端 共價結(jié)合形成的 位點 ，特稱為 雜種位點（ hybrid site）n 同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后，形成的新位點，不能再被原來的酶所識別。5’G 3’CCTAG GATCT3’ A5’ BamH I Bgl Ⅱ5’GGATCT3’ 3’CCTAGA5’ BamH I Bgl ⅡSau 3A同尾酶的粘性末端結(jié)合形成的新位點不能再被原來的酶識別BamH I G GATCCBgl II A GATCTMbo I, Sau3A I N GATCN酶切位點在 DNA上出現(xiàn)的頻率1. ?II型限制性內(nèi)切酶的酶切位點在 DNA上出現(xiàn)的頻率受 DNA的長度、識別位點的長度以及GC含量的影響。2. ?當 GC： AT＝ 1： 13. 4bp的識別位點： 1/44＝ 256 bp如： HaeIII GGCC4. 6bp的識別位點： 1/46＝ 4096 bp5. ?因此當一個酶的識別位點為 6bp時，在 DNA上每 4000bp才會出現(xiàn)一次。五、 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性? 另外一些不常見的酶識別位點相對較長，在 DNA鏈上出現(xiàn)頻率也相對較低。 ① 如 FseI GGCCGGCC，出現(xiàn)頻率為 1/48。? 實際上由于不同生物體的 DNA堿基含量不同，酶的識別位點的分布和頻率也不同。 ② 大腸桿菌基因組中 AT含量較豐富，所以富含 AT的識別序列 (如 DraI： TTTAAA； PshBI： ATTATT；SspI： AATTAA)較為頻繁的出現(xiàn)； ③ 鏈霉菌基因組因 GC含量高，相應的富含 GC堿基對的識別序列 (NaeI： GCCGGC； SmaI： CCCGGG；SacII： CCGCGG)較常見。?真核生物中， DNA中的 CG:GC=1:3，這也影響酶切位點的出現(xiàn)頻率。7五、 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性對寡核苷酸的活性? 盡管是雙鏈、有識別位點，但因為太短，酶不能與 DNA有效結(jié)合，所以不能切割。? 當 2個酶切位點距離非常近的時候，它們之間由于競爭結(jié)合位點，所以也會相互干擾。五、 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性9. 其它特異性的內(nèi)切酶及其用途1. λ 末端酶（ λ terminase ）： 5’GGGCGGCGACCTN3’ N5’，出現(xiàn)的頻率約 412 分子量為 117,000 = 1 A（ 74,000） + 2 Nul（ 21,000）2. Omega核酸酶（ ISceI）： 由內(nèi)含子編碼，用于 rRNA的剪切，出現(xiàn)的頻率約418 = X 1010 bp， 其識別順序為 5’TAGGGATAACAGGGTAAT3’ TATT 3. IPpoI： 來自于 Physarum polycephalum 識別序列： CTCTCTTAA GGTAGC AATT4. 用途 : 遺傳標記， 構(gòu)建載體五、 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性內(nèi)切酶的定義三、限制性內(nèi)切酶的命名四、限制性內(nèi)切酶的分類五、 II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶與 DNA分子的體外切割Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶的反應條件五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素216。 酶的純度216。 DNA樣品的純度216。 DNA的甲基化程度216。 酶切反應的溫度和時間216。 DNA分子的結(jié)構(gòu)216。 限制性內(nèi)切核酸酶的反應緩沖液六、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素高質(zhì)量的限制性核酸內(nèi)切酶，要求 :? 不存在其他核酸內(nèi)切酶或外切酶的污染 。? 長時間酶解不出現(xiàn)識別順序特異性的下降 。? 酶解的 DNA片段連接后能重新被識別和切割等 .? 酶的純度1. DNA制劑中可能抑制限制性核酸內(nèi)切酶活性的物質(zhì) : 蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精 乙二胺四乙酸（ EDTA） 十二烷基硫酸鈉（ SDS） 高濃度的鹽離子等? DNA樣品的純度 低濃低純度 DNA制劑反應效率的方法① 純化 DNA；② 增加核酸內(nèi)切酶的用量，平均每微克底 物 DNA可高達 10單位甚至更多些；③ 擴大酶催化反應的體積，以使?jié)撛诘囊? 制因素被響應地稀釋；④ 延長酶