【正文】 第二章 基因工程中常用的工具酶基因工程的基本流程TOOLS FOR GENE CLONINGSCISSORS: RESTRICTION ENZYMES GLUE: DNA LIGASE VEHICLE: PLASMID OR VIRAL VECTORS第二章 基因工程中常用的工具酶第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶與 DNA分子的 體外切割第二節(jié) DNA連接酶和 DNA分子的體外連接第三節(jié) 其他工具酶一、限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性?xún)?nèi)切酶的定義三、限制性?xún)?nèi)切酶的命名四、限制性?xún)?nèi)切酶的分類(lèi)五、 II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶與 DNA分子的體外切割一、限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和細(xì)菌的限制 — 修飾作用細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)? 1950年代初期，兩組科學(xué)家?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了限制修飾現(xiàn)象，當(dāng)時(shí)稱(chēng)為宿主專(zhuān)一性 : 1952年， Luria, Humann等： T偶數(shù)噬菌體 , 1953年， Bertani, Weigle 等： λ和 P2噬菌體。? 大量的研究結(jié)果證實(shí) λ噬菌體所表現(xiàn)的宿主限制和修飾現(xiàn)象更具普遍性和代表性。E. coliλ 噬菌體的限制修飾模式 ? ? 噬菌體在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時(shí)會(huì)受到限制。? 仍有少量 λ(K) 可在 B中生存，是因 B對(duì) λ(K) 進(jìn)行了修飾。1959年，瑞士塞爾生物研究中心 Arber提出限制一修飾理論： 核酸內(nèi)切酶降解細(xì)菌外源 DNA, 修飾酶保護(hù)自身 DNA2. 細(xì)菌的限制 — 修飾理論的提出侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源 DNA（非甲基化），能被限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別和降解，細(xì)菌通過(guò)這種方式進(jìn)行自我保護(hù)。n 細(xì)菌自身的 DNA可被甲基化酶修飾，① Dam甲基化酶 在 GATC序列的 腺嘌呤 N6位引入甲基。② Dcm甲基化酶 在 CCAGG序列的第 2個(gè) 胞嘧啶 C5位引入甲基。2. 細(xì)菌的限制 — 修飾理論n 細(xì)菌自身的 DNA可被甲基化酶修飾，從而防止限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別和水解。? Werner Arber于 19621968年發(fā)現(xiàn)限制與修飾體系，1968年分離得到 I型限制酶 EcoB.? 1970 年， H. Smith 首次從流感嗜血桿菌 （ H. influenzae） 中發(fā)現(xiàn)并分離到 II型限制酶 HindⅡ.? 1971年， D. Nathans用 HindII繪制了猿猴病毒 SV40的限制酶譜。 Arber, Smith和 Nathans 獲得了 1978 年 Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。3. 限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)? 到 1986 年下半年，發(fā)現(xiàn) 615 種限制酶和 98 種甲基化酶。? 到 2023 年 2 月，共發(fā)現(xiàn) 4583 種限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 3773 種， Ⅰ 型、Ⅱ 型和 Ⅲ 型限制酶各有 68 、 3692 、 10 種。3. 限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)一、限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性?xún)?nèi)切酶的定義三、限制性?xún)?nèi)切酶的命名四、限制性?xún)?nèi)切酶的分類(lèi)五、 II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶與 DNA分子的體外切割? 限制性?xún)?nèi)切酶系統(tǒng)中有兩個(gè)部分組成： ?來(lái)源：細(xì)菌染色體、噬菌體 /病毒?限制性?xún)?nèi)切酶不僅受病毒感染的影響，還可隨 DNA的連接、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染而傳給其他個(gè)體二、限制性核酸內(nèi)切酶的定義?限制性?xún)?nèi)切酶 是一組可以特異性地識(shí)別 DNA上的某一特定序列，并將之水解的核酸酶。 限制性核酸內(nèi)切酶，是一類(lèi)能夠識(shí)別雙鏈 DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割 DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。n 限制酶裂解 DNA雙鏈的磷酸二酯鍵n 酶切得到 5`P和3`OH一、限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性?xún)?nèi)切酶的定義三、限制性?xún)?nèi)切酶的命名四、限制性?xún)?nèi)切酶的分類(lèi)五、 II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶與 DNA分子的體外切割三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名① 第 1個(gè)字母大寫(xiě)，表示來(lái)源物種屬名的第一個(gè)字母。② 第 3個(gè)字母小寫(xiě)，表示來(lái)源物種種名的前二個(gè)字母。③ 如果細(xì)菌有不同的血清型，則有第四個(gè)字母，小寫(xiě)，且與前 3個(gè)字母緊緊排在一起。Hind Ⅲ ： Haemophilus influensae d④ 當(dāng)控制宿主的限制、修飾系統(tǒng)的遺傳因子位于病毒和質(zhì)粒上時(shí)，需要在名稱(chēng)中標(biāo)出遺傳成分。Eco RI： Escherichia coli R⑤ 若從一種細(xì)菌中分離出幾種不同的酶，則根據(jù)發(fā)現(xiàn)順序用羅馬數(shù)字表示。Sac I (II)： Streptomyces achromagenes I(Ⅱ)一、限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性?xún)?nèi)切酶的定義三、限制性?xún)?nèi)切酶的命名四、限制性?xún)?nèi)切酶的分類(lèi)五、 II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶與 DNA分子的體外切割性質(zhì) 酶 Ⅰ 酶 Ⅱ 酶 Ⅲ結(jié)構(gòu)與功能 三亞基多功能酶 單一功能的酶同型二聚體二亞基雙功能的酶限制與修飾 酶蛋白 同時(shí) 具有甲基化作用酶蛋白 不 具有甲基化作用酶蛋白 同時(shí) 具有甲基化作用限制作用的輔助因子ATP,Mg2+,SAM（ S腺苷甲硫氨酸）Mg2+ ATP,Mg2+,SAM寄主特異性位點(diǎn)序列特異性 ,非對(duì)稱(chēng) 序列特異性 ,旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng) 序列特異性 ,非對(duì)稱(chēng) 序列切割位點(diǎn) 在距寄主特異性位點(diǎn) 至少 1kb的地方位于寄主 特異性位點(diǎn) 或 其附近在距寄主 特異性位點(diǎn) 3180。端 24~26bp處切割方式 隨機(jī) 切割 特異 切割 特異 切割甲基化作用位點(diǎn)寄主特異性的位點(diǎn) 寄主特異性的位點(diǎn) 寄主特異性的位點(diǎn)在 DNA克隆中的用途無(wú) 十分有用 有用四、限制性核酸內(nèi)切酶的分類(lèi)及主要特征一、限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性?xún)?nèi)切酶的定義三、限制性?xún)?nèi)切酶的命名四、限制性?xún)?nèi)切酶的分類(lèi)五、 II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶與 DNA分子的體外切割五、 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性? 是用途最廣、最簡(jiǎn)單的一種限制性?xún)?nèi)切酶。? II型限制性?xún)?nèi)切酶的形式多樣，從大小上來(lái)說(shuō)，它們可以小到如 PvuII (157個(gè)氨基酸 )，也可以比 1250個(gè)氨基酸的 CjeI更大。在已純化分類(lèi)的 3000種限制性?xún)?nèi)切酶中，已發(fā)現(xiàn)了超過(guò) 250種的特異識(shí)別序列。?根據(jù)酶的作用特點(diǎn)， II型限制性?xún)?nèi)切酶分為 3類(lèi)： HhaI、 HindIII和 NotI這樣在識(shí)別序列中進(jìn)行切割的酶。有以下 4種情況： a)大部分這類(lèi)酶都以同源二聚體的形式結(jié)合到 DNA上，因而識(shí)別的是對(duì)稱(chēng)序列；b)但有極少的酶作為單聚體結(jié)合到 DNA上，識(shí)別非對(duì)稱(chēng)序列。c)一些酶識(shí)別連續(xù)的序列