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正文內(nèi)容

基因工程第二章1jun(參考版)

2025-01-09 17:55本頁面
  

【正文】 8:41:58 下午 8:41 下午 20:41:58三月 21MOMODA 三月 218:41 下午 三月 2120:41March 11, 2023n 1業(yè) 余生活要有意 義 ,不要越 軌 。三月 21三月 2120:41:5820:41:58March 11, 2023n 1意志 堅(jiān) 強(qiáng) 的人能把世界放在手中像泥 塊 一 樣 任意揉捏。 20:41:5820:41:5820:41Thursday, March 11, 2023n 1知人者智,自知者明。20:41:5820:41:5820:413/11/2023 8:41:58 PMn 1越是沒有本 領(lǐng) 的就越加自命不凡。 8:41:58 下午 8:41 下午 20:41:58三月 21n 楊 柳散和 風(fēng) ,青山澹吾 慮 。三月 218:41 下午 三月 2120:41March 11, 2023n 1少年十五二十 時(shí) ,步行 奪 得胡 馬騎 。 11 三月 20238:41:58 下午 20:41:58三月 21n 1楚塞三湘接, 荊門 九派通。 20:41:5820:41:5820:41Thursday, March 11, 2023n 1不知香 積 寺,數(shù)里入云峰。 20:41:5820:41:5820:413/11/2023 8:41:58 PMn 1成功就是日復(fù)一日那一點(diǎn)點(diǎn)小小努力的 積 累。 8:41:58 下午 8:41 下午 20:41:58三月 21n 沒有失 敗 ,只有 暫時(shí) 停止成功!。三月 218:41 下午 三月 2120:41March 11, 2023n 1行 動(dòng) 出成果,工作出 財(cái) 富。 11 三月 20238:41:58 下午 20:41:58三月 21n 1比不了得就不比,得不到的就不要。 20:41:5820:41:5820:41Thursday, March 11, 2023n 1乍 見 翻疑夢(mèng),相悲各 問 年。 20:41:5820:41:5820:413/11/2023 8:41:58 PMn 1以我獨(dú)沈久,愧君相 見頻 。n 靜夜四無 鄰 ,荒居舊 業(yè)貧 。Southern Blot法n DNA酶切后,電泳分離。3. 限制酶酶切圖譜的分析EcoR1NotI EcoRI NotI kb kb kbEcoRINotIEcoRI/NotI kb kb kb kb kb kb4. 酶切產(chǎn)物的檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳法n DNA經(jīng)內(nèi)切酶酶切,然后在瓊脂糖凝膠電泳分析。1 2 3 41 42. 限制性內(nèi)切酶圖譜定義n DNA上某些限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的圖譜,可作為 DNA片段的特殊標(biāo)記。完全酶切n 如 EcoR I( GAATTC)的 4個(gè)位點(diǎn)都被切開。部分酶切 /消化n DNA上只有部分酶切位點(diǎn)被切開。 限制酶的部分酶切與完全酶切七、限制內(nèi)切酶的用途限制性內(nèi)切酶酶切圖譜(Restriction mapping)1. 限制酶對(duì) DNA的酶切方法完全酶切 /消化n 對(duì) DNA上所有的識(shí)別位點(diǎn)都被酶切開。 突變分析( RFLP分析)216。 抑制星星活性的措施 o 減少酶的用量(可避免過分酶切)o 減少甘油濃度o 保證反應(yīng)體系中無有機(jī)溶劑或乙醇o(jì) 提高離子強(qiáng)度到 100~ 150mM (但不能抑制酶活性)o 降低反應(yīng) pH 至 o 保證使用 Mg++ 作為二價(jià)陽離子一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性內(nèi)切酶的定義三、限制性內(nèi)切酶的命名四、限制性內(nèi)切酶的分類五、 II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶與 DNA分子的體外切割216。 7:二甲基亞砜 (8%)。 ? 限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液4. 星號(hào)活性( star actvity)① 概念(以 EcoRⅠ 為例) EcoRⅠ 在正常條件下識(shí)別并切割GAATTC,但在 甘油 濃度 超過 5%( V/V)時(shí),也可切割 NAATTN(其中 N=A、 T、 C、 G),用 EcoRⅠ *表示。③ 使用適合所有限制酶的通用緩沖液,如 KGB(谷氨酸鉀緩沖液)? 限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液3. 限制性內(nèi)切核酸酶的多酶聯(lián)合酶解? 限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液4. 星號(hào)活性( star actvity) 限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)是在特定的消化條件下測(cè)定的,當(dāng) 條件改變 時(shí),有些酶的 識(shí)別位點(diǎn) 也隨之 改變 ,可能切割一些與特異識(shí)別序列相 類似 的序列,這種現(xiàn)象稱為 星號(hào)活性 。牛血清白蛋白( BSA) :對(duì)某些限制酶是必需的,它 是一種中性蛋白,可防止酶在低濃度 蛋白質(zhì)溶液中變性。NaCl 或 KCl: 同上。對(duì)絕大數(shù)限制 酶來說, 最佳 pH = 。限制酶對(duì)要求作用的 DNA序列有兩個(gè)明顯不同的結(jié)合位點(diǎn),其中一個(gè)是為 DNA切割時(shí)激活另一個(gè)的變構(gòu)位點(diǎn)。造成位點(diǎn)偏愛現(xiàn)象的原因 216。切割時(shí)并非在 5 個(gè)位點(diǎn)隨機(jī)進(jìn)行,靠近右端的位點(diǎn)比分子中間的位點(diǎn)切割快 10 倍。 切不動(dòng) CGGTCGACCG 切不動(dòng) CCGGTCGACCGG 切不動(dòng) eg: EcoRI GGAATTCC CGGAATTCCG 2小時(shí)內(nèi) 90%完全酶切 eg: PmeI GTTTAAAC 20小時(shí)不能切 GGTTTAAACC 20小時(shí), 25%切開 GGGTTTAAACCC 20小時(shí), 50%切開 AGCTTTGTTTAAACGGCGGCCGG 20小時(shí), 90%切開位點(diǎn)偏愛( Site preference) 某些限制酶對(duì)不同位置的同一個(gè)識(shí)別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作 位點(diǎn)偏愛 。DNA末端長(zhǎng)度對(duì)限制酶切割的影響 : 限制酶切割 DNA 時(shí)對(duì)識(shí)別序列兩端的非識(shí)別序列有長(zhǎng)度的要求,也就是說在 識(shí)別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸 ,否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。216。 但是大多數(shù)限制性核酸內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn) 反應(yīng)溫度都是 37℃ 。? DNA的甲基化? 酶切反應(yīng)的溫度 DNA酶切反應(yīng)的溫度是影響限制性內(nèi)切核酸酶活性的另一個(gè)重要因素。部分限制性內(nèi)切酶對(duì)甲基化的 DNA不能切割,如 FbaI和 MboI等。 限制性內(nèi)切核酸酶:破壞入侵的外源 DNA, 防御異源遺傳信息進(jìn)入體內(nèi)。? 酶解的 DNA片段連接后能重新被識(shí)別和切割等 .? 酶的純度1. DNA制劑中可能抑制限制性核酸內(nèi)切酶活性的物質(zhì) : 蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精 乙二胺四乙酸( EDTA) 十二烷基硫酸鈉( SDS) 高濃度的鹽離子等? DNA樣品的純度 低濃低純度 DNA制劑反應(yīng)效率的方法① 純化 DNA;② 增加核酸內(nèi)切酶的用量,平均每微克底 物 DNA可高達(dá) 10單位甚至更多些;③ 擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積
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