中國海洋大學基因工程l4第二章pcr技術(shù)(已修改)
2024-09-28 20:32 本頁面
【正文】 ?第二章 PCR技術(shù) 一、 PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展 ? 聚合酶鏈反應(yīng) （ Polymerase Chain Reaction， PCR ）又稱為 PCR ? 擴增技術(shù)，是一種高效、快速、特異性的體外 DNA聚合程序。 ? 1985年 ，美國 PEcetus公司人類遺傳研究室的 ? Kary Mullis發(fā)明了具有劃時代意義的 PCR技術(shù)； ? 1988年 ，美國 PEcetus公司推出世界上第一臺 ? PCR熱循環(huán)儀，從而使 PCR反應(yīng)自動化； ? 1993年 ， Kary Mullis因發(fā)明 PCR技術(shù)獲得諾貝 ? 爾化學獎； ? 1995年 ，定量 PCR儀誕生，使定量研究 DNA靶序列成為現(xiàn)實。 ? 定義：在體外的無細胞體系中模擬天然 DNA復制過程的使目的 DNA的量增加的反應(yīng)。 二、 原理 循環(huán) denature 94 ?C 30S annealing Tm5 ?C elongate 72 ?C cycle 2535 ? 三、 PCR反應(yīng)成分 ? 引物 (Primer): 1530nt ? 設(shè)計原則 ? *引物間 ACGC ? GAGC ? *引物內(nèi) AACTGTT ? *GC% ? *末端保守性 ? *兼并堿基 ? Taq酶 ? DNA聚合酶對 PCR精確性的重要影響 ? DNA聚合酶的保真性主要取決于其 3’→5’ 的核酸外切酶活性，它 ? 負責對錯誤摻入的堿基進行校正。相關(guān)研究結(jié)果表明， DNA聚合酶的 ? 出錯率在每輪延伸每核苷酸 X 10–6 X 10–4范圍內(nèi)。 DNA聚合 ? 酶的堿基摻入錯誤可能發(fā)生在其延伸階段的五種活性： ? 與 dNTP的結(jié)合特異性 ? 磷酸二酯鍵的形成速率 ? 焦磷酸的釋放速率 ? 堿基錯誤摻入之后的持續(xù)延伸性 ? 3’→5’ 的核酸外切活性的強弱 ?用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 Klenow Thermus aquaticus 72?C 35100nt/s/mol The large spring above, near Great Fountain Geyser, Yellowstone, was the source of the culture of Thermus Aquaticus Taq , discovered by Thomas Brock, U. Wisconsin in 1968). ? Taq DNA酶的聚合出錯率較高（ ），因為它沒有 3’→5’ 的 ? 的核酸外切酶活性和校正功能。然而通過優(yōu)化反應(yīng)條件，可使 Taq酶 ? 的聚合出錯率降低到原來的 1/3。 Taq DNA聚合酶催化的聚合反應(yīng)的 ? 的可能性，則 Taq DNA酶還常常導致擴增產(chǎn)物的缺失突變。 ? Taq DNA聚合酶（ Thermus aquaticus） ? 普遍錯誤類型是由 AT轉(zhuǎn)換為 GC；如果模板 DNA具有形成二級結(jié)構(gòu) 避免稀釋保存 Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在室溫下也具有延伸引物的活性 (Hot Start) ? Taq DNA酶在使用時應(yīng)注意： ? 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 ? KlenTaq DNA聚合酶 是一種 N端缺失了 的 Taq DNA聚合酶，因而 ? 沒有 5’的核酸外切酶活性； ? KlenTaq DNA聚合酶 的 Mg2+最佳濃度范圍很寬，因此很容易優(yōu)化 ? KlenTaq DNA聚合酶（ Thermus aquaticus） ? 在最佳反應(yīng)條件下
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