【正文】 ，以使?jié)撛诘囊? 制因素被響應(yīng)地稀釋；④ 延長酶催化反應(yīng)的保溫時間。 限制性內(nèi)切核酸酶的反應(yīng)緩沖液六、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素高質(zhì)量的限制性核酸內(nèi)切酶，要求 :? 不存在其他核酸內(nèi)切酶或外切酶的污染 。 酶切反應(yīng)的溫度和時間216。 DNA樣品的純度216。五、 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性9. 其它特異性的內(nèi)切酶及其用途1. λ 末端酶（ λ terminase ）： 5’GGGCGGCGACCTN3’ N5’，出現(xiàn)的頻率約 412 分子量為 117,000 = 1 A（ 74,000） + 2 Nul（ 21,000）2. Omega核酸酶（ ISceI）： 由內(nèi)含子編碼，用于 rRNA的剪切，出現(xiàn)的頻率約418 = X 1010 bp， 其識別順序為 5’TAGGGATAACAGGGTAAT3’ TATT 3. IPpoI： 來自于 Physarum polycephalum 識別序列： CTCTCTTAA GGTAGC AATT4. 用途 : 遺傳標記， 構(gòu)建載體五、 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性內(nèi)切酶的定義三、限制性內(nèi)切酶的命名四、限制性內(nèi)切酶的分類五、 II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶與 DNA分子的體外切割Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素216。7五、 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性對寡核苷酸的活性? 盡管是雙鏈、有識別位點，但因為太短，酶不能與 DNA有效結(jié)合，所以不能切割。 ② 大腸桿菌基因組中 AT含量較豐富，所以富含 AT的識別序列 (如 DraI： TTTAAA； PshBI： ATTATT；SspI： AATTAA)較為頻繁的出現(xiàn)； ③ 鏈霉菌基因組因 GC含量高，相應(yīng)的富含 GC堿基對的識別序列 (NaeI： GCCGGC； SmaI： CCCGGG；SacII： CCGCGG)較常見。 ① 如 FseI GGCCGGCC，出現(xiàn)頻率為 1/48。2. ?當 GC： AT＝ 1： 13. 4bp的識別位點： 1/44＝ 256 bp如： HaeIII GGCC4. 6bp的識別位點： 1/46＝ 4096 bp5. ?因此當一個酶的識別位點為 6bp時，在 DNA上每 4000bp才會出現(xiàn)一次。 由 一對同尾酶 分別產(chǎn)生的 粘性末端 共價結(jié)合形成的 位點 ，特稱為 雜種位點（ hybrid site）n 同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后，形成的新位點，不能再被原來的酶所識別。 用途 由于同尾酶切割 DNA后產(chǎn)生的是粘性末端，因此，可以通過粘性末端之間的互補作用而彼此連接起來，這在基因克隆實驗中是很有用處的。 ... C T A G^ ... 5180。 ... ^G A T C ... 3180。 ... T C T A G^A ... 5180。 ... A^G A T C T ... 3180。 ... C C T A G^G ... 5180。 ... G^G A T C C ... 3180。 舉例 與同裂酶對應(yīng)的一類限制性酶，它們雖然 來源各異 ，識別的 靶序列也各不相同 ，但都產(chǎn)生出 相同的粘性末端 ，這類酶稱為同尾酶。 概念 常用的限制酶 BamHⅠ 、 BacⅡ 、 BglⅡ 、 Sau3AⅠ和 XhoⅡ 就是一組同尾酶，它們切割 DNA后都形成由GATC 4個核苷酸組成的粘性末端。所以，通過比較HpaⅡ 和 MspⅠ 的 DNA消化產(chǎn)物就可以檢測出甲基化的存在。當其靶序列中含有一個 5甲基胞嘧啶（ CCGG，*號表示甲基化的堿基）， HpaⅡ 不能夠切割它，而 MspⅠ 對于這個核苷酸的甲基化作用的反應(yīng)則是中性的，它不管 C殘基甲基化與否都能夠切割之。216。 用途 有一些同裂酶對于切割位點上的甲基化堿基的敏感性有所差別，所以可以用來研究 DNA甲基化作用。 CTCGAG (1).識別不同，切割不同 eg: BamHI EcoRI G GATC ? C A ? GATCT C ? CTAG G T CTAG ? A (2).識別不同，切割產(chǎn)生末端相同 (同尾酶 ) eg: BamHI Bg1Ⅱ A ? GATC T G ? GATC C T CTAG ? A C CTAG ? G五、 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性(3).識別相同，切割不同 eg: SmaI XmaI CCC ? GGG C ? CCGG GGG ? CCC G GGCC ? C(4)．識別相同，切割相同 ── 同工酶 ? 同裂酶 eg: HpaⅡ Msp Ⅰ CC?GG C * C ? GG GG ? CC G G ? CC同裂酶（ isoschizomers）216。 CTCGGG。 BbvCⅠ 補平成平齊末端n 粘性末端可以用 DNA聚合酶補平成平齊末端。5’ 末端標記n 凸出的 5’ 末端可用 DNA多核苷酸激酶進行 32P標記。這比連接兩個平齊末端容易的多。 （ 2）平末端（ Blunt end） 在回文對稱軸上同時切割 DNA 的兩條鏈，則產(chǎn)生平末端。AlwNⅠ C A G N N N C T G G T C N N N G A C AccⅠ G T M K A C C A K M T G M = A、 CK = G、 T（ 4）限制酶切割的位置 限制酶對 DNA 的切割位置大多數(shù)在識別序列內(nèi)部，但也有在外部的。EcoRI 5’G A A T T C3’ 3’C T T A A G5’ ?有些限制酶的識別序列不對稱 AccBSⅠ C C G ↓ C T C G G C ↑ G