【正文】 四、純化過程的質(zhì)量控制 五、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制 一、醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量保證的一般性要點 1. 產(chǎn)品安全性評價 根據(jù)各個具體品種的情況，提出各不相同的安全性評價要求，這類制品安全性臨床試驗設(shè)計方案與試驗范圍須根據(jù)不同情況作不同規(guī)定。 ④折疊復(fù)性方法易于放大。 ②正確復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯誤折疊蛋白質(zhì)分離。此外，由于金屬離子具有氧化催化作用，還常常需要加入金屬螯合劑如 EDTA以除去金屬離子。 二、包含體的分離和溶解 包含體的溶解一般都用強的變性劑如脲、鹽酸胍或硫氰酸鹽，或去垢劑如 SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物等；對于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，還需加入還原劑如巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇及半胱氨酸。 二、包含體的分離和溶解 （ 1）對培養(yǎng)收集的重組菌進行破碎（高壓勻漿、超聲波破碎等），為了提 高破碎率，可以加入一定量的溶菌酶。 2. 重組蛋白在大腸桿菌中表達時，缺乏一些蛋白折疊過程中需要的酶和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，也導(dǎo)致包含體的形成。 第八節(jié) 變性蛋白的復(fù)性 一、包含體形成的原因 二、包含體的分離和溶解 三、包含體蛋白復(fù)性方法 一、包含體形成的原因 包含體形成的原因主要是高水平表達的結(jié)果。 （ 6）工藝和技術(shù)必須高效，收率高，易操作，對設(shè)備要求低，能耗低。 （ 4）在工藝過程中要盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟，或干 擾產(chǎn)品質(zhì)量。 （ 2）要盡可能減少組成工藝的步驟。經(jīng)過色譜分離 ， 一般能除去病毒 ， 必要時可以用紫外線照射使病毒失活 ， 或過濾將病毒除去 。 六、非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)的去除 3. 病毒的去除 成品中必須檢查是否含有病毒 。 六、非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)的去除 2. 熱原質(zhì)的去除 （ 1） 整個生產(chǎn)過程在無菌條件下進行 ， 防止產(chǎn)生熱原質(zhì) 。 （ 3） 利用 親和層析 吸附蛋白質(zhì) ， 而 DNA不被吸附 ， 也可分離 。 大分子先從色譜柱中流出 六、非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)的去除 1. DNA的去除 （ 1） DNA在 pH 4. 0以上呈陰離子 ， 可用 陰離子交換劑 吸附除去 ， 但目的蛋白質(zhì) PI應(yīng)在 6. 0以上 。 五、重組蛋白質(zhì)的分離純化 3. 親和層析： 是利用固定化配體與目的蛋白質(zhì)之間非常特異的生物親和力進行吸附 ， 這種結(jié)合既是特異的 ， 又是可逆的 ， 改變條件可以使這種結(jié)合解除 。 疏水層析最常用填料是多聚糖 （ 如瓊脂糖 ） 及硅膠 。 五、重組蛋白質(zhì)的分離純化 1. 離子交換層析： 是以離子交換劑為固定相 ， 依據(jù)流動相中的組分離子與交換 劑上的平衡離子進行可逆交換時 的結(jié)合力大小的差別而進行分離 的一種層析方法 。 二、分離純化的基本過程 分離純化的技術(shù)特點： ① 條件溫和 ② 選擇性好 ③ 收率要高 ④ 純化過程快速 三、細胞的破碎方法 1. 細胞收集 2. 細胞破碎 ???膜過濾離心 物理破碎法：高壓勻漿法、高速珠磨法、 超聲破碎法、高壓擠壓法 化學(xué)破碎法：滲透沖擊、增溶法、 脂溶法 生物破碎法：酶溶法（溶菌酶、甘露糖酶 、 殼多糖酶等） 超聲破碎法 四、固液分離 分離細胞碎片常用的方法有 ： 1. 離心沉淀：高速離心、超速離心 2. 膜過濾：微濾、超濾和反滲透 3. 雙水相萃?。壕垡叶?葡聚糖 聚乙二醇 無機鹽 五、重組蛋白質(zhì)的分離純化 分離純化主要依賴色譜分離方法 。允許的雜質(zhì)種類和最大允許含量，特殊雜質(zhì) 的種類和最大允許量，以及對使用的影響，產(chǎn)品劑型、貯存穩(wěn)定性 等。 包括化學(xué)組成、相對分子質(zhì)量、等電點、電荷分布及密度、溶解度、穩(wěn)定性 (對熱、冷凍、 pH、鹽、有機溶劑和金屬離子等 )、疏水性、擴散性、擴散系數(shù)、分配系數(shù)、吸附性能、生物活性、親和性、配基種類、表面活性等。 一、建立分離純化工藝需了解的各種因素 2. 物料中雜質(zhì)種類和性質(zhì) 物料中雜質(zhì)種類和性質(zhì)包括相關(guān)性和非相關(guān)性雜質(zhì)的含量、 化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量、電荷性質(zhì)及數(shù)量、生物學(xué)特性、 穩(wěn)定性 (對熱、 pH、鹽、有機溶劑等 )、溶解度、分配系數(shù)、揮發(fā)性 及吸附性能等。包括滅菌方法和條件，生產(chǎn)方式 (連續(xù)、批 式、半連續(xù) )，生產(chǎn)周期，生產(chǎn)能力，工藝控制條件及方式等； （ 4）初始物料的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性。 第七節(jié) 基因工程藥物的分離純化 一、建立分離純化工藝需了解的各種因素 1. 含目的產(chǎn)物的初始物料的特點 利用基因工程菌進行發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)物，其上游過程中的各種因素 均對分離純化技術(shù)和工藝有直接影響。 2. 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性： 指 DNA從質(zhì)粒上丟失或堿基重排 、 缺失所致工程菌性能的改變 。 主要與兩個因素有關(guān)： （ 1） 含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代的頻率 ， 質(zhì)粒丟失率與 宿主菌 、 質(zhì)粒特性和培養(yǎng)條件有關(guān) 。 三、酵母中的基因表達 ④ YIP（酵母整合型質(zhì)粒） 含有可與染色體進行同源重組的序列 ⑤酵母表達型質(zhì)粒 ⑥分泌型表達質(zhì)粒 帶有控制蛋白質(zhì)分泌的信號序列 三、酵母中的基因表達 2． 影響目的基因在酵母中表達的因素 （ 1） 外源基因的拷貝數(shù) （ 2） TATA盒啟動子成分 （ 3） 分泌信號序列 （ 4） 終止序列 （ 5） 翻譯后修飾 （ 6） 對宿主影響 三、酵母中的基因表達 基因工程菌在傳代過程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象 ， 質(zhì)粒不穩(wěn)定分為分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定 。 ② YRP（ 酵母復(fù)制型質(zhì)粒 ） ARS來自染色體 DNA、 TrP URA3雙標(biāo)及大腸桿菌質(zhì)粒 。 （ 2） 非融合表達 。 ③ 在外源基因的 N末端可融合 6個 His， 便于純化 。 ④ CITS857抑制子基因 （ 溫控誘導(dǎo) ）