【文章內(nèi)容簡介】 包括化學(xué)組成、相對分子質(zhì)量、等電點、電荷分布及密度、溶解度、穩(wěn)定性 (對熱、冷凍、 pH、鹽、有機溶劑和金屬離子等 )、疏水性、擴散性、擴散系數(shù)、分配系數(shù)、吸附性能、生物活性、親和性、配基種類、表面活性等。 二、建立分離純化工藝需了解的各種因素 4. 產(chǎn)品質(zhì)量要求 產(chǎn)品質(zhì)量要求主要包括產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)，產(chǎn)品用途，對純度、生 物活性、比活的要求。允許的雜質(zhì)種類和最大允許含量，特殊雜質(zhì) 的種類和最大允許量，以及對使用的影響，產(chǎn)品劑型、貯存穩(wěn)定性 等。 二、分離純化的基本過程 基因工程藥物的分離純化一般包括細胞破碎、固液分離、濃縮與初 步純化、高度純化直至得到純品、成品加工等步驟。 二、分離純化的基本過程 分離純化的技術(shù)特點： ① 條件溫和 ② 選擇性好 ③ 收率要高 ④ 純化過程快速 三、細胞的破碎方法 1. 細胞收集 2. 細胞破碎 ???膜過濾離心 物理破碎法：高壓勻漿法、高速珠磨法、 超聲破碎法、高壓擠壓法 化學(xué)破碎法：滲透沖擊、增溶法、 脂溶法 生物破碎法：酶溶法（溶菌酶、甘露糖酶 、 殼多糖酶等） 超聲破碎法 四、固液分離 分離細胞碎片常用的方法有 ： 1. 離心沉淀：高速離心、超速離心 2. 膜過濾：微濾、超濾和反滲透 3. 雙水相萃取：聚乙二醇 葡聚糖 聚乙二醇 無機鹽 五、重組蛋白質(zhì)的分離純化 分離純化主要依賴色譜分離方法 。 色譜技術(shù)包括： 離子交換色譜 、 疏水色譜 、 反相色譜 、 親和色譜 、 凝膠過濾色譜 、 高效液相色譜等 。 五、重組蛋白質(zhì)的分離純化 1. 離子交換層析： 是以離子交換劑為固定相 ， 依據(jù)流動相中的組分離子與交換 劑上的平衡離子進行可逆交換時 的結(jié)合力大小的差別而進行分離 的一種層析方法 。 pH、 兩性分子 、 側(cè)鏈 、 ?? ?? C O ONH 3五、重組蛋白質(zhì)的分離純化 2. 疏水層析： 是利用蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域與固定相上疏水性基團相互作用力的差異 ， 對蛋白質(zhì)組分進行分離的層析方法 。 疏水層析最常用填料是多聚糖 （ 如瓊脂糖 ） 及硅膠 。 利用氨基酸側(cè)鏈的疏水鍵 。 五、重組蛋白質(zhì)的分離純化 3. 親和層析： 是利用固定化配體與目的蛋白質(zhì)之間非常特異的生物親和力進行吸附 ， 這種結(jié)合既是特異的 ， 又是可逆的 ， 改變條件可以使這種結(jié)合解除 。 五、重組蛋白質(zhì)的分離純化 4. 凝膠過濾層析： 又稱為凝膠排阻層析 、 分子篩層析 ， 是以多孔性凝膠填料為固定相 ， 按分子大小對溶液中各組分進行分離的液相層析方法 。 大分子先從色譜柱中流出 六、非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)的去除 1. DNA的去除 （ 1） DNA在 pH 4. 0以上呈陰離子 ， 可用 陰離子交換劑 吸附除去 ， 但目的蛋白質(zhì) PI應(yīng)在 6. 0以上 。 （ 2） 如蛋白質(zhì)為強酸性 ， 則可選擇條件使其吸附在 陽離子交換劑 上 ， 而不讓 DNA吸附上去 。 （ 3） 利用 親和層析 吸附蛋白質(zhì) ， 而 DNA不被吸附 ， 也可分離 。 （ 4） 疏水層析 對分離也有效 ， 在上柱時需要高鹽濃度 ， 使 DNA蛋 白質(zhì)結(jié)合物離解 ， 蛋白質(zhì)吸附在柱上 ， 而 DNA不被吸附 。 六、非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)的去除 2. 熱原質(zhì)的去除 （ 1） 整個生產(chǎn)過程在無菌條件下進行 ， 防止產(chǎn)生熱原質(zhì) 。 （ 2） 所有層析介質(zhì)在使用前先除去熱原質(zhì) ， 在 2~8℃ 下進 行操作 ， 洗脫液需先經(jīng)無菌處理 ， 流出的蛋白質(zhì)溶液 也應(yīng)無菌處理 ， 即通過 0. 2μm微濾膜 ， 并在 2~8℃ 下保存 。 六、非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)的去除 3. 病毒的去除 成品中必須檢查是否含有病毒 。 病毒主要來源于宿主細胞 。經(jīng)過色譜分離 ， 一般能除去病毒 ， 必要時可以用紫外線照射使病毒失活 ， 或過濾將病毒除去 。 七、選擇分離純化方法的依據(jù) 1. 根據(jù)產(chǎn)物表達形式來選擇 2. 根據(jù)分離單元之間的銜接選擇 3. 根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇 （ 1）要具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。 （ 2）要盡可能減少組成工藝的步驟。 （ 3）組成工藝的各技術(shù)或步驟之間要能相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)，工藝與設(shè) 備也能相互適應(yīng)。 （ 4）在工藝過程中要盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟，或干 擾產(chǎn)品質(zhì)量。 （ 5）工藝時間要盡可能短。 （ 6）工藝和技術(shù)必須高效，收率高，易操作，對設(shè)備要求低，能耗低。 （ 7）具有較高的安全性。 第八節(jié) 變性蛋白的復(fù)性 一、包含體形成的原因 二、包含體的分離和溶解 三、包含體蛋白復(fù)性方法 一、包含體形成的原因 包含體形成的原因主要是高水平表達的結(jié)果。 1. 在高水平表達時，新生肽鏈的聚 集速率一旦超過蛋白正確折疊的速率就會導(dǎo)致包含體的形成。 2. 重組蛋白在大腸桿菌中表達時，缺乏一些蛋白折疊過程中需要的酶和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，也導(dǎo)致包含體的形成。 電鏡下包含體顆粒 一、包含體形成的原因 包含體雖然由無活性的蛋白組成，但包含體形成對重組蛋白的生產(chǎn)提供了幾個優(yōu)勢： 1. 包含體具有高密度，易于分離純化； 2. 重組蛋白以包含體的形式存在有效地抵御了大腸桿菌中的蛋白酶對目的蛋白的降解； 3. 用于生產(chǎn)處于天然構(gòu)象對宿主細胞有毒害的蛋白。 二、包含體的分離和溶解 （ 1）對培養(yǎng)收集的重組菌進行破碎（高壓勻漿、超聲波破碎等），為了提 高破碎率，可以加入一定量的溶菌酶。 （ 2）離心除去破碎上清液，沉淀部分用含有低濃度的變性劑（如脲和鹽酸 胍）、去垢劑（如 Triton X100）、脫氧膽酸鈉等化合物的緩沖液進行 洗滌，如果需要對包含體進行純化，一般多采用蔗糖密度梯度離心法。 二、包含體的分離和溶解 包含體的溶解一般都用強的變性劑如脲、鹽酸胍或硫氰酸鹽，或去垢劑如 SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物等；對于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，還需加入還原劑如巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇及半胱氨酸。溫度一般選擇在 30℃ 以促進溶解。此外，由于金屬離子具有氧化催化作用，還常常需要加入金屬螯合劑如 EDTA以除去金屬離子。 三、包含體蛋白復(fù)性方法 有效的、理