【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 包括化學(xué)組成、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、電荷分布及密度、溶解度、穩(wěn)定性 (對(duì)熱、冷凍、 pH、鹽、有機(jī)溶劑和金屬離子等 )、疏水性、擴(kuò)散性、擴(kuò)散系數(shù)、分配系數(shù)、吸附性能、生物活性、親和性、配基種類(lèi)、表面活性等。 二、建立分離純化工藝需了解的各種因素 4. 產(chǎn)品質(zhì)量要求 產(chǎn)品質(zhì)量要求主要包括產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)，產(chǎn)品用途，對(duì)純度、生 物活性、比活的要求。允許的雜質(zhì)種類(lèi)和最大允許含量，特殊雜質(zhì) 的種類(lèi)和最大允許量，以及對(duì)使用的影響，產(chǎn)品劑型、貯存穩(wěn)定性 等。 二、分離純化的基本過(guò)程 基因工程藥物的分離純化一般包括細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初 步純化、高度純化直至得到純品、成品加工等步驟。 二、分離純化的基本過(guò)程 分離純化的技術(shù)特點(diǎn)： ① 條件溫和 ② 選擇性好 ③ 收率要高 ④ 純化過(guò)程快速 三、細(xì)胞的破碎方法 1. 細(xì)胞收集 2. 細(xì)胞破碎 ???膜過(guò)濾離心 物理破碎法：高壓勻漿法、高速珠磨法、 超聲破碎法、高壓擠壓法 化學(xué)破碎法：滲透沖擊、增溶法、 脂溶法 生物破碎法：酶溶法（溶菌酶、甘露糖酶 、 殼多糖酶等） 超聲破碎法 四、固液分離 分離細(xì)胞碎片常用的方法有 ： 1. 離心沉淀：高速離心、超速離心 2. 膜過(guò)濾：微濾、超濾和反滲透 3. 雙水相萃取：聚乙二醇 葡聚糖 聚乙二醇 無(wú)機(jī)鹽 五、重組蛋白質(zhì)的分離純化 分離純化主要依賴色譜分離方法 。 色譜技術(shù)包括： 離子交換色譜 、 疏水色譜 、 反相色譜 、 親和色譜 、 凝膠過(guò)濾色譜 、 高效液相色譜等 。 五、重組蛋白質(zhì)的分離純化 1. 離子交換層析： 是以離子交換劑為固定相 ， 依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換 劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí) 的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離 的一種層析方法 。 pH、 兩性分子 、 側(cè)鏈 、 ?? ?? C O ONH 3五、重組蛋白質(zhì)的分離純化 2. 疏水層析： 是利用蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域與固定相上疏水性基團(tuán)相互作用力的差異 ， 對(duì)蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離的層析方法 。 疏水層析最常用填料是多聚糖 （ 如瓊脂糖 ） 及硅膠 。 利用氨基酸側(cè)鏈的疏水鍵 。 五、重組蛋白質(zhì)的分離純化 3. 親和層析： 是利用固定化配體與目的蛋白質(zhì)之間非常特異的生物親和力進(jìn)行吸附 ， 這種結(jié)合既是特異的 ， 又是可逆的 ， 改變條件可以使這種結(jié)合解除 。 五、重組蛋白質(zhì)的分離純化 4. 凝膠過(guò)濾層析： 又稱(chēng)為凝膠排阻層析 、 分子篩層析 ， 是以多孔性凝膠填料為固定相 ， 按分子大小對(duì)溶液中各組分進(jìn)行分離的液相層析方法 。 大分子先從色譜柱中流出 六、非蛋白質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)的去除 1. DNA的去除 （ 1） DNA在 pH 4. 0以上呈陰離子 ， 可用 陰離子交換劑 吸附除去 ， 但目的蛋白質(zhì) PI應(yīng)在 6. 0以上 。 （ 2） 如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性 ， 則可選擇條件使其吸附在 陽(yáng)離子交換劑 上 ， 而不讓 DNA吸附上去 。 （ 3） 利用 親和層析 吸附蛋白質(zhì) ， 而 DNA不被吸附 ， 也可分離 。 （ 4） 疏水層析 對(duì)分離也有效 ， 在上柱時(shí)需要高鹽濃度 ， 使 DNA蛋 白質(zhì)結(jié)合物離解 ， 蛋白質(zhì)吸附在柱上 ， 而 DNA不被吸附 。 六、非蛋白質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)的去除 2. 熱原質(zhì)的去除 （ 1） 整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程在無(wú)菌條件下進(jìn)行 ， 防止產(chǎn)生熱原質(zhì) 。 （ 2） 所有層析介質(zhì)在使用前先除去熱原質(zhì) ， 在 2~8℃ 下進(jìn) 行操作 ， 洗脫液需先經(jīng)無(wú)菌處理 ， 流出的蛋白質(zhì)溶液 也應(yīng)無(wú)菌處理 ， 即通過(guò) 0. 2μm微濾膜 ， 并在 2~8℃ 下保存 。 六、非蛋白質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)的去除 3. 病毒的去除 成品中必須檢查是否含有病毒 。 病毒主要來(lái)源于宿主細(xì)胞 。經(jīng)過(guò)色譜分離 ， 一般能除去病毒 ， 必要時(shí)可以用紫外線照射使病毒失活 ， 或過(guò)濾將病毒除去 。 七、選擇分離純化方法的依據(jù) 1. 根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來(lái)選擇 2. 根據(jù)分離單元之間的銜接選擇 3. 根據(jù)分離純化工藝的要求來(lái)選擇 （ 1）要具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。 （ 2）要盡可能減少組成工藝的步驟。 （ 3）組成工藝的各技術(shù)或步驟之間要能相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)，工藝與設(shè) 備也能相互適應(yīng)。 （ 4）在工藝過(guò)程中要盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟，或干 擾產(chǎn)品質(zhì)量。 （ 5）工藝時(shí)間要盡可能短。 （ 6）工藝和技術(shù)必須高效，收率高，易操作，對(duì)設(shè)備要求低，能耗低。 （ 7）具有較高的安全性。 第八節(jié) 變性蛋白的復(fù)性 一、包含體形成的原因 二、包含體的分離和溶解 三、包含體蛋白復(fù)性方法 一、包含體形成的原因 包含體形成的原因主要是高水平表達(dá)的結(jié)果。 1. 在高水平表達(dá)時(shí)，新生肽鏈的聚 集速率一旦超過(guò)蛋白正確折疊的速率就會(huì)導(dǎo)致包含體的形成。 2. 重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，缺乏一些蛋白折疊過(guò)程中需要的酶和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，也導(dǎo)致包含體的形成。 電鏡下包含體顆粒 一、包含體形成的原因 包含體雖然由無(wú)活性的蛋白組成，但包含體形成對(duì)重組蛋白的生產(chǎn)提供了幾個(gè)優(yōu)勢(shì)： 1. 包含體具有高密度，易于分離純化； 2. 重組蛋白以包含體的形式存在有效地抵御了大腸桿菌中的蛋白酶對(duì)目的蛋白的降解； 3. 用于生產(chǎn)處于天然構(gòu)象對(duì)宿主細(xì)胞有毒害的蛋白。 二、包含體的分離和溶解 （ 1）對(duì)培養(yǎng)收集的重組菌進(jìn)行破碎（高壓勻漿、超聲波破碎等），為了提 高破碎率，可以加入一定量的溶菌酶。 （ 2）離心除去破碎上清液，沉淀部分用含有低濃度的變性劑（如脲和鹽酸 胍）、去垢劑（如 Triton X100）、脫氧膽酸鈉等化合物的緩沖液進(jìn)行 洗滌，如果需要對(duì)包含體進(jìn)行純化，一般多采用蔗糖密度梯度離心法。 二、包含體的分離和溶解 包含體的溶解一般都用強(qiáng)的變性劑如脲、鹽酸胍或硫氰酸鹽，或去垢劑如 SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物等；對(duì)于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，還需加入還原劑如巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇及半胱氨酸。溫度一般選擇在 30℃ 以促進(jìn)溶解。此外，由于金屬離子具有氧化催化作用，還常常需要加入金屬螯合劑如 EDTA以除去金屬離子。 三、包含體蛋白復(fù)性方法 有效的、理