第二章基因工程制藥(一)-文庫吧資料
2024-11-19 22:12本頁面
【正文】 應(yīng)用。 用表達(dá)型載體構(gòu)建的cDNA文庫，可用免疫學(xué)方法分組逐一鑒定各cDNA的表達(dá)產(chǎn)物，即以某種蛋白質(zhì)的抗體尋找相應(yīng)的特異cDNA克隆。 根據(jù)目的蛋白質(zhì)純品的氨基酸序列分析結(jié)果，人工合成相應(yīng)的單鏈寡核苷酸作為探針，從cDNA文庫中分離特異cDNA克隆。 然后采用凝膠電泳、分子雜交、DNA序列分析測(cè)定等方法進(jìn)行進(jìn)一步篩選和鑒定。 或轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌使質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 選用表達(dá)型載體可以增加目的基因的篩選方法，有利于目的基因的篩選。,21,第二章 基因工程制藥,cDNA克隆,在cDNA克隆操作中應(yīng)該根據(jù)不同的需要選擇適當(dāng)?shù)妮d體。 根據(jù)重組后插入的cDNA是否能夠表達(dá)、能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)，又將載體分為表達(dá)型和非表達(dá)型載體。 發(fā)夾結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)切除后，雙鏈cDNA分子的大小常用變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測(cè)定。,19,第二章 基因工程制藥,cDNA第二鏈的合成,此反應(yīng)是在DNA聚合酶I催化下完成的。,核糖核酸酶H (RNase H)是一種核糖核酸內(nèi)切酶，它能夠特異性地水解雜交DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，故能分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈。,18,第二章 基因工程制藥,cDNA第二鏈的合成,先用堿解或RNaseH酶解的方法除去cDNAmRNA雜交鏈中的mRNA鏈，然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。,17,第二章 基因工程制藥,cDNA第一鏈的合成,在凝膠電泳后，進(jìn)行放射自顯影分析產(chǎn)物的分子大小，探索最佳反應(yīng)條件。,16,第二章 基因工程制藥,cDNA第一鏈的合成,一般mRNA都帶有3‘polyA，所以可用寡聚dT作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開始cDNA鏈的合成。,mRNA(messengerRNA)，信使RNA rRNA(（ribosomal RNA），核糖體RNA ， tRNA(（tranfer RNA），轉(zhuǎn)移tRNA）、,15,第二章 基因工程制藥,mRNA 的純化,用高濃度鹽溶液使mRNA特異結(jié)合于寡聚dT。,13,第二章 基因工程制藥,逆轉(zhuǎn)錄法的步驟,mRNA的純化 cDNA第一鏈的合成 cDNA第二鏈的合成 cDNA克隆 將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞 cDNA文庫的鑒定 目的cDNA克隆的分離和鑒定,14,第二章 基因工程制藥,mRNA 的純化,細(xì)胞內(nèi)含有三種RNA，mRNA 占RNA 總量的2%5%，相對(duì)分子量大小不一致，分離也有很大的困難。 從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞中提取mRNA，以其為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成該蛋白質(zhì)mRNA的互補(bǔ)DNA(complementary DNA )，再以互補(bǔ)DNA 為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA 聚合酶作用下，最終合成編碼該蛋白質(zhì)的雙鏈DNA 序列。 另外，真核基因一般都有內(nèi)含子，如果以原核細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，即使分離出真核基因，由于原核細(xì)胞缺乏mRNA 轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)，真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA 也不能被加工、拼接成為成熟的mRNA ，因此不能直接克隆真核基因。 對(duì)于真核生物不能進(jìn)行直接分離。上游階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成； 下游技術(shù)：主要指的是從工程菌（或細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化、質(zhì)量控制等。,6,第二章 基因工程制藥,二、基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程,基因工程技術(shù)就是將重組對(duì)象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌，實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。,3,第二章 基因工程制藥,利用基
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