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第二章基因工程工具酶-文庫(kù)吧資料

2024-11-19 22:12本頁(yè)面
  

【正文】 分子間連接,形成線性二聚體或多聚體分子。,?,是雙鏈-因此不能將兩條單鏈連接起來(lái)或使單鏈環(huán)化起來(lái)。,E.coli DNA連接酶 -連接具互補(bǔ)堿基黏性末端(最初研究表明),現(xiàn)在研究可連接平末端;需NAD+輔助因子,活性低,不常用。 概念: DNA連接酶(Ligase) 能夠催化兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶。 首個(gè)DNA連接酶(ligase)——1967年,大腸桿菌DNA連接酶,是大腸桿菌基因編碼 。 cDNA合成時(shí)去掉第一連與第二連的發(fā)夾結(jié)構(gòu) 測(cè)定DNA上內(nèi)含子的位置,?,(一)DNA連接酶的概念與作用機(jī)制 (二) 連接酶種類及特性的比較 (三) DNA連接酶作用的特點(diǎn) (四) DNA連接酶的反應(yīng)條件 (五)影響連接反應(yīng)的因素DNA連接的策略 (六)T4 DNA連接酶對(duì)目的DNA片段和 載體連接的一般方案,二、 DNA連接酶及其應(yīng)用,DNA重組的核心技術(shù):DNA片段之間的體外連接 ——連接酶。同時(shí)也可作用于雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)(小到一個(gè)堿基)。巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)(防止酶氧化,以保持活性) BSA(牛血清白蛋白)穩(wěn)定酶蛋白。反應(yīng)時(shí)間與酶量有關(guān)。 解決辦法:擴(kuò)大反應(yīng)體積 20?L—50?L 延長(zhǎng)酶作用時(shí)間 1h—數(shù)小時(shí) 增加酶用量 1u—10u,?,(3)DNA甲基化程度 甲基化程度高不被大多數(shù)限制性內(nèi)切酶切割,解決辦法是: 選用無(wú)甲基化酶的突變菌株; 使用對(duì)甲基化酶堿基無(wú)切割能力的酶(對(duì)哺乳動(dòng)物DNA)。 (2)DNA純度 鉑,酚 ,氯仿,酒精,EDTA,SDS,鹽離子等均影響酶活性。,?,星號(hào)活力的產(chǎn)生可為酶提供新的序列特異性,這些活性在某些情況下可能是有用的,但是很少導(dǎo)致第二識(shí)別位點(diǎn)的完全或同等的切割,因此為了避免星活力的出現(xiàn),所有限制性酶切反應(yīng)均應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下,通常反應(yīng)條件通過(guò)緩沖液控制。 限制性內(nèi)切酶的第二活力 (Secondary activity,又稱星號(hào)活力) 指改變了酶的反應(yīng)條件,使酶原有的識(shí)別特異性的降低。,?,酶活單位 一個(gè)限制酶單位(U)指:在理想的反應(yīng)條件(適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度,通常為37℃)下,1h內(nèi)中完全降解1 ?g ? DNA所需要的酶量。,?,4. 不具有甲基化功能 II型限制性核酸內(nèi)切酶的甲基化修飾作用由相應(yīng)的甲基化酶承擔(dān)。但轉(zhuǎn)化后不能再用這兩種酶鑒定。 在B情況下,產(chǎn)生重組體。 在A情況下產(chǎn)生的重組體只能被一種酶消化,減少了可逆反應(yīng),提高了重組率。 與切割。,?,平齊末端,帶5’-P端的黏性末端,帶3’-OH 和5’-P端的平末端,例如HpaⅡ和MspⅠ是同裂酶,識(shí)別順序都是 5’……C|CG G……3’ 3’……G GC|C……5’ 如果其中有5’甲基胞嘧啶,HpaⅡ不能夠切割,MspI能切割。 同尾酶 isocaudamers 識(shí)別的靶序列不同,但能產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶。 同裂酶 isoschizomers 能識(shí)別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同來(lái)源的內(nèi)切酶。 平 末 端 Blunt end在識(shí)別序列對(duì)稱處同時(shí)切開(kāi)DNA分子兩條鏈,產(chǎn)生的平齊末端結(jié)構(gòu)。,能識(shí)別外源DNA并將其水解的內(nèi)切核酸酶,是細(xì)菌對(duì)外源DNA的防御機(jī)制。 識(shí)別序列的對(duì)稱性 靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱 的結(jié)構(gòu),即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。,?,(二)限制性核酸內(nèi)切酶的類型及其主要特性,特性 1. 限制修飾活性 2. 內(nèi)切酶的蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu) 3. 限制輔助因子 4. 切割位點(diǎn) 5. 特異性切割 6. 基因克隆中,I 型 雙功能的酶 3種不同亞基 ATP、Mg2+和S腺苷甲硫氨酸 距特異性位點(diǎn)5‘端至少1000bp 不是(隨機(jī)) 無(wú)用,II 型 限制酶和修飾酶分開(kāi) 單一成分 Mg2+ 位于識(shí)別位點(diǎn)上 是 非常有用,III 型 雙功能酶 2種亞基 ATP、Mg2+和S腺苷甲硫氨酸 特異性位點(diǎn)3‘端2426bp處 是 用處不大,?,(三)限制性核酸內(nèi)切酶的命名,寄主菌屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)斜體 字母的略語(yǔ)表示酶來(lái)源的菌種名稱,如大腸桿菌Escherichia coli 表示為Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示為 Hin; 用一個(gè)正體字母表示菌株的類型,比如EcoR、Hind; 如果一種特殊的寄主菌株具有幾個(gè)不同的限制修飾體系,則 用羅馬數(shù)字標(biāo)出,比如Eco R I、 Hind III。 概念: 限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease ) 一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列,并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。,?,從此,相關(guān)研究展開(kāi)。 1970年美國(guó)的O. Nat
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