第二章基因工程制藥(二)-文庫(kù)吧資料
2024-11-19 22:12本頁(yè)面
【正文】 酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生。 適當(dāng)提高pH，可減少乙酸的抑制作用。,31,第二章 基因工程制藥,菌體的生長(zhǎng)與能量的關(guān)系,碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。,30,第二章 基因工程制藥,基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn),大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體的生長(zhǎng)速度反映了蛋白質(zhì)的合成速度。 工程菌培養(yǎng)可通過(guò)選用不同的碳源控制補(bǔ)料和稀釋速率等方法來(lái)控制菌體的生長(zhǎng)。 通過(guò)間歇供氧和改變稀釋數(shù)率，都可以提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。 調(diào)控環(huán)境參數(shù)如溫度、pH、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度。,25,第二章 基因工程制藥,質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法,樣品,不含抗性標(biāo)記抗 生素平板培養(yǎng)基,稀釋,培養(yǎng)10～12h,隨機(jī)挑選 100個(gè)菌落,含抗性標(biāo)記抗 生素平板培養(yǎng)基,接種,統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)出的 菌落數(shù),培養(yǎng)10～12h,計(jì)算比值,重復(fù)三次,26,第二章 基因工程制藥,提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法,為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程菌培養(yǎng)采用兩階段培養(yǎng)法： 先使菌體生長(zhǎng)至一定密度 再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá),27,第二章 基因工程制藥,提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法,由于第一階段外源基因未表達(dá)，減小了重組菌與質(zhì)粒丟失菌的生長(zhǎng)速率的差別，增加了質(zhì)粒穩(wěn)定性。,23,第二章 基因工程制藥,質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因,常見(jiàn)的是分裂不穩(wěn)定，與兩個(gè)因素有關(guān)： 含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率； 這兩種菌的比生長(zhǎng)速率差異的大小。,20,第二章 基因工程制藥,動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá),缺點(diǎn)： 細(xì)胞生長(zhǎng)慢，生產(chǎn)率低 條件刻苛，費(fèi)用高 培養(yǎng)液濃度較小 表達(dá)的外源細(xì)胞均為傳代細(xì)胞 表達(dá)產(chǎn)物是否致癌尚有疑問(wèn),21,第二章 基因工程制藥,主要基因工程表達(dá)體系比較,22,第二章 基因工程制藥,五、基因工程菌的穩(wěn)定性,基因工程菌在傳代過(guò)程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象。,18,第二章 基因工程制藥,宿主菌株的影響,菌體生長(zhǎng)力強(qiáng) 菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱 菌體性能穩(wěn)定 分泌能力強(qiáng),19,第二章 基因工程制藥,動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá),優(yōu)點(diǎn)： 哺乳動(dòng)物細(xì)胞外源基因表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分泌到培養(yǎng) 液中，使產(chǎn)物易純化。 外源蛋白經(jīng)糖基化后可以以有效的活性型分泌到培養(yǎng)基中。 終止序列保證了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在適當(dāng)?shù)牟课唤K止和加上多聚腺苷酸尾巴，這樣形成的mRNA可能比較穩(wěn)定并被有效地翻譯。,16,第二章 基因工程制藥,外源基因的表達(dá)效率,要使外源基因在酵母中表達(dá)必須將外源基因克隆到酵母軍表達(dá)載體的啟動(dòng)子和終止子之間，構(gòu)成表達(dá)框架。 精確表達(dá)載體：要求在啟動(dòng)子或前導(dǎo)肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切酶位點(diǎn)，以利于接入外源基因，并使它在表達(dá)和加工后氮末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無(wú)多余的氨基酸，也無(wú)缺失的氨基酸。 從大腸桿菌中制備質(zhì)粒要比從酵母中容易得多，因此酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過(guò)大腸桿菌進(jìn)行的，只有在最后階段在轉(zhuǎn)入酵母中。 缺點(diǎn)：產(chǎn)量不高， 信號(hào)肽不被切割。,10,第二章 基因工程制藥,分泌型表達(dá)藥物基因,將外源基因接到信號(hào)肽之后，使之在胞質(zhì)內(nèi)有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯，當(dāng)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞外膜和細(xì)胞內(nèi)膜之間的周質(zhì)后時(shí)，被信號(hào)肽酶識(shí)別切割，從而釋放出有生物活性的外源基因表達(dá)產(chǎn)物。 優(yōu)點(diǎn)：保持原有蛋白活性?？稍偾懈畛蓛蓚€(gè)多肽鏈。 缺點(diǎn)：只能作抗原用。,8,第二章 基因工程制藥,融合蛋白形式表達(dá)藥物基因,融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，這樣的蛋白質(zhì)是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起的。 優(yōu)化培養(yǎng)條件使外源基因大量表達(dá)。 形成不溶性的包含體可以降低表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的
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