第二章基因工程制藥新版7-文庫吧資料
2024-11-19 22:12本頁面
【正文】 采用雜交翻譯法挑選含有干擾素cDNA的克隆 ↓ 將干擾素cDNA克隆進(jìn)表達(dá)載體 ↓ 在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá) （進(jìn)入下游工藝）,[B] 下游工藝流程,啟開種子 ↓ 制備種子液 ↓ 發(fā)酵培養(yǎng) ↓ 粗提 ↓ 精提 ↓ 半成品制備 ↓ 半成品鑒定 ↓ 分裝 ↓ 凍干 ↓ 成品鑒定 ↓ 成品包裝,人干擾素α2b的基因工程菌為SWIFNα2b/E.coli—DH5α。 （1）步驟 （2）流程圖,(1)步驟,分離人白細(xì)胞干擾素mRNA ↓ 將mRNA注射到蟾蜍的卵母細(xì)胞之中 ↓ 測定雜合干擾素的活性基因，發(fā)現(xiàn)12S mRNA的活性最高 ↓反轉(zhuǎn)錄酶 以12S mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ↓ 將cDNA克隆到含四環(huán)素+氨芐抗性基因的pBR322質(zhì)粒之中 ↓ 將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌K12之中 ↓ （1）將每個(gè)克隆用粗得的干擾素mRNA進(jìn)行雜交， （2）將雜交所得陽性克隆的DNA進(jìn)行再一次重組， （3）重組的DNA質(zhì)粒放到無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)中進(jìn)行試驗(yàn)性翻譯 （4）進(jìn)行多輪篩選最終得到能夠產(chǎn)生干擾素的cDNA。又根據(jù)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)不同將干擾素分為α1b、α2a、 α2b等亞型。它們具有很強(qiáng)的抗熱性和穩(wěn)定性，干燥器中在4℃以下，蛋白質(zhì)可保存相當(dāng)長的時(shí)間。 固態(tài)蛋白質(zhì)則較穩(wěn)定。含水量下降到5%時(shí)，在室溫、或者冰箱中保存較為穩(wěn)定。 （C）某些蛋白質(zhì)由于含有半胱氨酸的巰基，容易被氧化，形成次磺酸、和二硫化物，這類穩(wěn)定劑有2巰基乙醇、二硫蘇糖醇。 （5）保護(hù)劑保存： （A）某些蛋白質(zhì)在疏水環(huán)境中能夠長期保存，這類穩(wěn)定劑有糖類、脂肪、蛋白質(zhì)類、多元醇、有機(jī)溶劑。 （3）高濃度保存蛋白質(zhì)在高濃度溶液中比較穩(wěn)定，而在低濃度溶液內(nèi)，常常發(fā)生亞基解離、表面變性。,產(chǎn)品的安全性,三致試驗(yàn)： （1）致畸 （2）致敏 （3）致癌,（五）：產(chǎn)品的保存要求,液態(tài)保存 固態(tài)保存,液態(tài)保存,（1）低溫保存在10℃到20℃以下的低溫環(huán)境，可保存蛋白質(zhì)制劑。,產(chǎn)品一致性保證,是用來保證每一批生產(chǎn)出的最終產(chǎn)品在安全性、有效、含量、雜質(zhì)限度、穩(wěn)定性等方面都是一致的。 穩(wěn)定性試驗(yàn)必須與一致性試驗(yàn)、純度測定、生物學(xué)效價(jià)試驗(yàn)等結(jié)合起來，進(jìn)行多方面的綜合評判。 由于基因工程所生產(chǎn)出一蛋白質(zhì)都是生物活性物質(zhì)，它們對于溫度、氧化、光照、離子濃度、機(jī)械剪切等環(huán)境因素均十分敏感。,穩(wěn)定性考察,這是評價(jià)藥物有效性、安全性的重要手段。 （2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)法：根據(jù)目的蛋白質(zhì)的生物學(xué)、藥理學(xué)特性，建立動(dòng)物模型，進(jìn)行各種指標(biāo)的測定。 （C）宿主細(xì)胞所殘余的DNA，一般認(rèn)為DNA殘余含量小于100pg/劑量，是安全的。,（2）非蛋白質(zhì)雜質(zhì)主要類別,（A）雜菌污染，通過微生物學(xué)方法來測定。 采用的方法有4項(xiàng)： （1）聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAEG） （2）等電點(diǎn)電泳 （3）各種高效液相分析法（HPLC） （4）毛細(xì)管電泳（CE）,Isoelectric focusing,雜質(zhì)檢測,雜質(zhì)分為2 種類型：蛋白質(zhì)雜質(zhì)、非蛋白質(zhì)雜質(zhì)?；蚬こ坍a(chǎn)物中SS鍵是否正確配對為一個(gè)重要的問題。,（3）部份氨基酸序列分析,氨基酸Edman N末端序列分析法，可作為蛋白質(zhì)和肽鏈的重要測定指標(biāo)。 （2）當(dāng)氨基酸數(shù)量超過100個(gè)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)較大偏差。 方法可采用： （1）各種高效液相分析法（HPLC） （2）毛細(xì)管電泳（CE）,（2）氨基酸成份分析,對構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸單體進(jìn)行測定的方法。 肽圖分析法是檢測蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中細(xì)微變化最有效的方法。 外源蛋白質(zhì)含量限度檢驗(yàn) DNA限度檢驗(yàn) 熱原限度檢驗(yàn)： （1）血清學(xué)檢驗(yàn) （2）鱟試劑 （3）兔子熱敏試驗(yàn),（四）目的產(chǎn)品的質(zhì)量控制,基因工程產(chǎn)品的質(zhì)量控制包括7項(xiàng)指標(biāo)。 定期檢測工程菌的載體系統(tǒng)、質(zhì)?？截悢?shù)、載體在工程細(xì)胞內(nèi)是否丟失。 生產(chǎn)過程保證產(chǎn)量恒定。 發(fā)酵生產(chǎn)過程中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定。 應(yīng)明確以下各事項(xiàng)： （1）目的基因的來源 （2）限制性內(nèi)切酶的種類 （3）載體的名稱和遺傳特性 （4）基因重組的位點(diǎn)圖譜 （5）抗生素標(biāo)記物 （6）宿主細(xì)胞的名稱和來源、傳代歷史 （7）重組染色體的生物特性、拷貝數(shù)、遺傳性 （8）基因表達(dá)所導(dǎo)讀的核苷酸序列 （9）啟動(dòng)克隆基因在工程細(xì)菌中的表達(dá)水平,（二）培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),工程菌菌種純正、穩(wěn)定。 進(jìn)行重組的基因工程菌必須來自單一克隆株。,7 人工分子伴侶促進(jìn)的復(fù)性,變性蛋白被復(fù)性液中的去垢劑所捕獲，形成蛋白去垢劑復(fù)合物，該復(fù)合物可抑制蛋白的聚集，之后，加入環(huán)糊精從復(fù)合體中去除去垢劑，促使蛋白的重折疊。添加劑并不加快折疊速率，只是抑制聚集發(fā)生。,4 凝膠過濾層析復(fù)性,為減少高濃度下的聚集反應(yīng)，使用凝膠過濾層析介質(zhì)的隔離作用，降
公司管理相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1