【正文】 、限制性核酸內(nèi)切酶的分類(lèi)及主要特征一、限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性?xún)?nèi)切酶的定義三、限制性?xún)?nèi)切酶的命名四、限制性?xún)?nèi)切酶的分類(lèi)五、 II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶與 DNA分子的體外切割五、 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性? 是用途最廣、最簡(jiǎn)單的一種限制性?xún)?nèi)切酶。③ 如果細(xì)菌有不同的血清型，則有第四個(gè)字母，小寫(xiě)，且與前 3個(gè)字母緊緊排在一起。3. 限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)一、限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性?xún)?nèi)切酶的定義三、限制性?xún)?nèi)切酶的命名四、限制性?xún)?nèi)切酶的分類(lèi)五、 II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶與 DNA分子的體外切割? 限制性?xún)?nèi)切酶系統(tǒng)中有兩個(gè)部分組成： ?來(lái)源：細(xì)菌染色體、噬菌體 /病毒?限制性?xún)?nèi)切酶不僅受病毒感染的影響，還可隨 DNA的連接、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染而傳給其他個(gè)體二、限制性核酸內(nèi)切酶的定義?限制性?xún)?nèi)切酶 是一組可以特異性地識(shí)別 DNA上的某一特定序列，并將之水解的核酸酶。? Werner Arber于 19621968年發(fā)現(xiàn)限制與修飾體系，1968年分離得到 I型限制酶 EcoB.? 1970 年， H. Smith 首次從流感嗜血桿菌 （ H. influenzae） 中發(fā)現(xiàn)并分離到 II型限制酶 HindⅡ.? 1971年， D. Nathans用 HindII繪制了猿猴病毒 SV40的限制酶譜。1959年，瑞士塞爾生物研究中心 Arber提出限制一修飾理論： 核酸內(nèi)切酶降解細(xì)菌外源 DNA, 修飾酶保護(hù)自身 DNA2. 細(xì)菌的限制 — 修飾理論的提出侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源 DNA（非甲基化），能被限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別和降解，細(xì)菌通過(guò)這種方式進(jìn)行自我保護(hù)。其他工具酶一、限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性?xún)?nèi)切酶的定義三、限制性?xún)?nèi)切酶的命名四、限制性?xún)?nèi)切酶的分類(lèi)五、 II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶與 DNA分子的體外切割一、限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和細(xì)菌的限制 — 修飾作用細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)? 1950年代初期，兩組科學(xué)家?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了限制修飾現(xiàn)象，當(dāng)時(shí)稱(chēng)為宿主專(zhuān)一性 : 1952年， Luria, Humann等： T偶數(shù)噬菌體 , 1953年， Bertani, Weigle 等： λ和 P2噬菌體。DNA連接酶和 DNA分子的體外連接第三節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶與 DNA分子的 體外切割第二節(jié) 基因工程中常用的工具酶第一節(jié) ? 大量的研究結(jié)果證實(shí) λ噬菌體所表現(xiàn)的宿主限制和修飾現(xiàn)象更具普遍性和代表性。n 細(xì)菌自身的 DNA可被甲基化酶修飾，① Dam甲基化酶 在 GATC序列的 腺嘌呤 N6位引入甲基。 Arber, Smith和 Nathans 獲得了 1978 年 Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 限制性核酸內(nèi)切酶，是一類(lèi)能夠識(shí)別雙鏈 DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割 DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。Hind Ⅲ ： Haemophilus influensae d④ 當(dāng)控制宿主的限制、修飾系統(tǒng)的遺傳因子位于病毒和質(zhì)粒上時(shí)，需要在名稱(chēng)中標(biāo)出遺傳成分。? II型限制性?xún)?nèi)切酶的形式多樣，從大小上來(lái)說(shuō)，它們可以小到如 PvuII (157個(gè)氨基酸 )，也可以比 1250個(gè)氨基酸的 CjeI更大。c)一些酶識(shí)別連續(xù)的序列 (如 EcoRI識(shí)別 GAATTC)d)而另一些識(shí)別不連續(xù)的序列 (如 BglI識(shí)別 GCCNNNNNGGC)根據(jù)酶作用特點(diǎn)進(jìn)行的分類(lèi)五、 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性B. IIS型酶? 另一種比較常見(jiàn)的酶是所謂的 IIS型酶，比如FokI和 AlwI，它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)之外切開(kāi) DNA。 II型限制性?xún)?nèi)切酶? 第三種 II型限制性?xún)?nèi)切酶 (有時(shí)也被稱(chēng)為 IV型限制性?xún)?nèi)切酶 )是一類(lèi)較大的、集 限制和修飾 功能于一體的酶，通常由 8501250個(gè)堿基組成，在同一條多肽鏈上同時(shí)具有限制和修飾酶活性。當(dāng)這些酶與底物結(jié)合時(shí)，它們或行使限制性?xún)?nèi)切酶的功能切開(kāi)底物，或作為修飾酶將其甲基化。識(shí)別序列 MboI NGATCN； AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC： PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’ＧＧＡＴＧ (Ｎ )93’ 3’ＣＣＴＡＣ (Ｎ )135’ 外側(cè)，產(chǎn)生５ ’端突起五、 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性（ 3）限制酶識(shí)別序列的結(jié)構(gòu) ?限制酶識(shí)別序列大多具有回文對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu) AlwNⅠ C A G N N N C T G G T C N N N G A C AccⅠ G T M K A C C A K M T G M = A、 CK = G、 T（ 4）限制酶切割的位置 限制酶對(duì) DNA 的切割位置大多數(shù)在識(shí)別序列內(nèi)部，但也有在外部的。這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。補(bǔ)平成平齊末端n 粘性末端可以用 DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。 CTCGGG。 用途 有一些同裂酶對(duì)于切割位點(diǎn)上的甲基化堿基的敏感性有所差別，所以可以用來(lái)研究 DNA甲基化作用。當(dāng)其靶序列中含有一個(gè) 5甲基胞嘧啶（ CCGG，*號(hào)表示甲基化的堿基）， HpaⅡ 不能夠切割它，而 MspⅠ 對(duì)于這個(gè)核苷酸的甲基化作用的反應(yīng)則是中性的，它不管 C殘基甲基化與否都能夠切割之。 概念 常用的限制酶 BamHⅠ 、 BacⅡ 、 BglⅡ 、 Sau3AⅠ和 XhoⅡ 就是一組同尾酶，它們切割 DNA后都形成由GATC 4個(gè)核苷酸組成的粘性末端。 ... G^G A T C C ... 3180。 ... A^G A T C T ... 3180。 ... ^G A T C ... 3180。 用途 由于同尾酶切割 DNA后產(chǎn)生的是粘性末端，因此，可以通過(guò)粘性末端之間的互補(bǔ)作用而彼此連接起來(lái)，這在基因克隆實(shí)驗(yàn)中是很有用處的。2. ?當(dāng) GC： AT＝ 1： 13. 4bp的識(shí)別位點(diǎn)： 1/44＝ 256 bp如： HaeIII GGCC4. 6bp的識(shí)別位點(diǎn)： 1/46＝ 4096 bp5. ?因此當(dāng)一個(gè)酶的識(shí)別位點(diǎn)為 6bp時(shí)，在 DNA上每 4000bp才會(huì)出現(xiàn)一次。 ② 大腸桿菌基因組中 AT含量較豐富，所以富含 AT的識(shí)別序列 (如 DraI： TTTAAA； PshBI： ATTATT；SspI： AATTAA)較為頻繁的出現(xiàn)； ③ 鏈霉菌基因組因 GC含量高，相應(yīng)