中國(guó)海洋大學(xué)基因工程l4第二章pcr技術(shù)-wenkub
2022-10-09 20:32:27 本頁(yè)面
【正文】 一、 PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展 ? 聚合酶鏈反應(yīng) （ Polymerase Chain Reaction， PCR ）又稱為 PCR ? 擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效、快速、特異性的體外 DNA聚合程序。相關(guān)研究結(jié)果表明， DNA聚合酶的 ? 出錯(cuò)率在每輪延伸每核苷酸 X 10–6 X 10–4范圍內(nèi)。 ? Taq DNA聚合酶（ Thermus aquaticus） ? 普遍錯(cuò)誤類型是由 AT轉(zhuǎn)換為 GC；如果模板 DNA具有形成二級(jí)結(jié)構(gòu) 避免稀釋保存 Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在室溫下也具有延伸引物的活性 (Hot Start) ? Taq DNA酶在使用時(shí)應(yīng)注意： ? 用于 PCR的 DNA聚合酶簡(jiǎn)介 ? KlenTaq DNA聚合酶 是一種 N端缺失了 的 Taq DNA聚合酶，因而 ? 沒(méi)有 5’的核酸外切酶活性； ? KlenTaq DNA聚合酶 的 Mg2+最佳濃度范圍很寬，因此很容易優(yōu)化 ? KlenTaq DNA聚合酶（ Thermus aquaticus） ? 在最佳反應(yīng)條件下， KlenTaq DNA聚合酶 出錯(cuò)率為 X 10–5， ? 性能略優(yōu)于 Taq DNA聚合酶。 ? Mg2+ ? 模板 (Template) 制備和用量 ? 100bp~40kb 實(shí)際 3~5k ? 難于得到長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物的原因： ? *3’錯(cuò)配 ? *高溫下脫嘌呤 (depurination)或脫嘧啶 (deamination)Taq不能通過(guò) ? 100176。 1 2 3 4 Template + + + Primer1 + + + Primer2 + + + Verification of PCR products ? 六、 PCR污染控制 ? 設(shè)陰陽(yáng)對(duì)照 ? 操作分區(qū) ? 材料分裝 ? 防汽溶膠 ? 加樣順序 ? 使用專門儀器 ? 重復(fù) ? 七、 PCR技術(shù)應(yīng)用 ? 點(diǎn)突變技術(shù) ? 錨定 PCR（ anchored PCR APCR） ? 不對(duì)稱 PCR（ asymmetry PCR） ? 引物比例 1： 100 ? 表達(dá)子 PCR(expressioncassette PCR ECPCR） ? 酶切位點(diǎn) 克隆 ? 噬菌體啟動(dòng)子 單鏈探針 ? 蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn) 產(chǎn)物純化、檢測(cè) PCR技術(shù) 點(diǎn)突變 APCR ? 反向 PCR(inverse PCR） ? 原位 PCR ? RAPD(Random Amplification Polymorphic DNAs) ? 原理 引物 條件 應(yīng)用 ? 其它 ? 七、 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析 ? 凝膠電泳 ? 雜交 ? 微孔板夾心雜交法（特異性高） :通過(guò)一固定于微孔板的捕獲探針與 PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域特 異雜交使產(chǎn)物間接地固定于微孔板上，然后，再 利 用一生物素 等非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的檢測(cè)探針與產(chǎn)物的另一 區(qū)域的
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