第二章基因工程制藥(二)-wenkub
2024-11-19 22 本頁面
【正文】 低但對穩(wěn)定性不利。 基因產(chǎn)物糖基化接近天然產(chǎn)物。,17,第二章 基因工程制藥,外源蛋白的糖基化,外源蛋白在酵母細胞中可發(fā)生N糖苷鍵和O糖苷鍵連接的兩種不同的糖基化。,14,第二章 基因工程制藥,影響目的基因在酵母菌中表達的因素,外源基因的拷貝數(shù) 外源基因的表達效率 外源蛋白的糖基化 宿主菌株的影響,15,第二章 基因工程制藥,外源基因的拷貝數(shù),拷貝數(shù)要適當，高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體可使外源基因高效表達，但會引起細胞生長量的降低，單拷貝的質(zhì)粒載體對細胞的最大生長沒有影響，能達到較高效的表達。,11,第二章 基因工程制藥,酵母中的基因表達,載體： 酵母載體是可以攜帶外源基因在在酵母細胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分裂傳遞到子代細胞的DNA 或RNA單位。 缺點：易被蛋白酶破壞。原核多肽序列可能會影響真核蛋白的免疫原性。,7,第二章 基因工程制藥,真核基因在大腸桿菌中的表達形式,三種表達形式： 融合蛋白 非融合蛋白 分泌型。 另外通過將細胞的生長和外源基因的表達分成兩個階段，或?qū)⑺拗骷毎纳L與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開兩種手段也可以減輕細胞代謝的負荷。,2,第二章 基因工程制藥,外源基因的拷貝數(shù),外源基因是克隆到載體上的，所以載體在宿主中的拷貝數(shù)就直接與外源基因的表達相關(guān)，應(yīng)將外源基因克隆到高拷貝的質(zhì)粒載體上，這對于提高外源基因的總體表達水平非常有利。,3,第二章 基因工程制藥,外源基因的表達效率,啟動子的強弱 核糖體接合位點的有效性 SD序列和起始密碼ATG的間距 密碼子組成,4,第二章 基因工程制藥,表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性,利用大腸桿菌的信號肽或某些真核多肽中自身的信號肽，把真核基因產(chǎn)物運輸?shù)桨麧{周質(zhì)的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解； 組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白； 采用位點特異性突變的方法，改變真核蛋白二硫鍵的位置，從而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性； 選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細胞。 形成不溶性的包含體可以降低表達產(chǎn)物對宿主細胞的毒害作用。,8,第二章 基因工程制藥,融合蛋白形式表達藥物基因,融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，這樣的蛋白質(zhì)是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起的?？稍偾懈畛蓛蓚€多肽鏈。,10,第二章 基因工程制藥,分泌型表達藥物基因,將外源基因接到信號肽之后，使之在胞質(zhì)內(nèi)有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯，當表達的蛋白質(zhì)進入細胞外膜和細胞內(nèi)膜之間的周質(zhì)后時，被信號肽酶識別切割，從而釋放出有生物活性的外源基因表達產(chǎn)物。 從大腸桿菌中制備質(zhì)粒要比從酵母中容易得多，因此酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過大腸桿菌進行的，只有在最后階段在轉(zhuǎn)入酵母中。,16,第二章 基因工程制藥,外源基因的表達效率,要使外源基因在酵母中表達必須將外源基因克隆到酵母軍表達載體的啟動子和終止子之間，構(gòu)成表達框架。 外源蛋白經(jīng)糖基化后可以以有效的活性型分泌到培養(yǎng)基中。,20,第二章 基因工程制藥,動物細胞中的基因表達,缺點： 細胞生長慢，生產(chǎn)率低 條件刻苛，費用高 培養(yǎng)液濃度較小 表達的外源細胞均為傳代細胞 表達產(chǎn)物是否致癌尚有疑問,21,第二章 基因工程制藥,主要基因工程表達體系比較,22,第二章 基因工程制藥,五、基因工程菌的穩(wěn)定性,基因工程菌在傳代過程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象。,25,第二章 基因工程制藥,質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法,樣品,不含抗性標記抗 生素平板培養(yǎng)基,稀釋,培養(yǎng)10～12h,隨機挑選 100個菌落,含抗性標記抗 生素平板培養(yǎng)基,接種,統(tǒng)計長出的 菌落數(shù),培養(yǎng)
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