第二章基因工程制藥(二)-文庫(kù)吧
2024-11-19 22:12 本頁(yè)面
【正文】 smid，酵母著絲粒質(zhì)粒） YIp類(lèi)（yeast integrative plasmid，酵母整合型質(zhì)粒）,13,第二章 基因工程制藥,表達(dá)載體,普通表達(dá)載體：只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的組成，特別是對(duì)其氮末端氨基酸是否有增減并無(wú)嚴(yán)格要求。 精確表達(dá)載體：要求在啟動(dòng)子或前導(dǎo)肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切酶位點(diǎn)，以利于接入外源基因，并使它在表達(dá)和加工后氮末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無(wú)多余的氨基酸，也無(wú)缺失的氨基酸。,14,第二章 基因工程制藥,影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素,外源基因的拷貝數(shù) 外源基因的表達(dá)效率 外源蛋白的糖基化 宿主菌株的影響,15,第二章 基因工程制藥,外源基因的拷貝數(shù),拷貝數(shù)要適當(dāng)，高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體可使外源基因高效表達(dá)，但會(huì)引起細(xì)胞生長(zhǎng)量的降低，單拷貝的質(zhì)粒載體對(duì)細(xì)胞的最大生長(zhǎng)沒(méi)有影響，能達(dá)到較高效的表達(dá)。,16,第二章 基因工程制藥,外源基因的表達(dá)效率,要使外源基因在酵母中表達(dá)必須將外源基因克隆到酵母軍表達(dá)載體的啟動(dòng)子和終止子之間，構(gòu)成表達(dá)框架。 分泌信號(hào)包括信號(hào)肽部分以及前導(dǎo)肽部分的編碼序列，它幫助后面的表達(dá)產(chǎn)物分泌出酵母細(xì)胞，并在適當(dāng)?shù)牟课挥砂麅?nèi)蛋白酶加工切斷表達(dá)產(chǎn)物與前導(dǎo)肽之間的肽鍵，產(chǎn)生正確的表達(dá)產(chǎn)物。 終止序列保證了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在適當(dāng)?shù)牟课唤K止和加上多聚腺苷酸尾巴，這樣形成的mRNA可能比較穩(wěn)定并被有效地翻譯。,17,第二章 基因工程制藥,外源蛋白的糖基化,外源蛋白在酵母細(xì)胞中可發(fā)生N糖苷鍵和O糖苷鍵連接的兩種不同的糖基化。 外源蛋白經(jīng)糖基化后可以以有效的活性型分泌到培養(yǎng)基中。 某些蛋白質(zhì)糖基化后更加穩(wěn)定，便于分離精制。,18,第二章 基因工程制藥,宿主菌株的影響,菌體生長(zhǎng)力強(qiáng) 菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱 菌體性能穩(wěn)定 分泌能力強(qiáng),19,第二章 基因工程制藥,動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá),優(yōu)點(diǎn)： 哺乳動(dòng)物細(xì)胞外源基因表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分泌到培養(yǎng) 液中，使產(chǎn)物易純化。 基因產(chǎn)物糖基化接近天然產(chǎn)物。,20,第二章 基因工程制藥,動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá),缺點(diǎn)： 細(xì)胞生長(zhǎng)慢，生產(chǎn)率低 條件刻苛，費(fèi)用高 培養(yǎng)液濃度較小 表達(dá)的外源細(xì)胞均為傳代細(xì)胞 表達(dá)產(chǎn)物是否致癌尚有疑問(wèn),21,第二章 基因工程制藥,主要基因工程表達(dá)體系比較,22,第二章 基因工程制藥,五、基因工程菌的穩(wěn)定性,基因工程菌在傳代過(guò)程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象。 分裂不穩(wěn)定：是指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象； 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：是指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。,23,第二章 基因工程制藥,質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因,常見(jiàn)的是分裂不穩(wěn)定，與兩個(gè)因素有關(guān)： 含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率； 這兩種菌的比生長(zhǎng)速率差異的大小。,24,第二章 基因工程制藥,質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因,對(duì)同一工程菌控制不同的比生長(zhǎng)數(shù)率可改變質(zhì)粒的拷貝數(shù)： 低拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率高如增加工程菌質(zhì)?？截悢?shù)可提高穩(wěn)定性； 高拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率低但對(duì)穩(wěn)定性不利。,25,第二章 基因工程制藥,質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法,樣品,不含抗性標(biāo)記抗 生素平板培養(yǎng)基,稀釋,培養(yǎng)10～12h,隨機(jī)挑選 100個(gè)菌落,含抗性標(biāo)記抗 生素平板培養(yǎng)基,接種,統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)出的 菌落數(shù),培養(yǎng)10～12h,計(jì)算比值,重復(fù)三次,26,第二章 基因工程制藥,提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法,為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程菌培養(yǎng)采用兩階段培養(yǎng)法： 先使菌體生長(zhǎng)
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