【文章內(nèi)容簡介】 制、產(chǎn)物誘導(dǎo)表達(dá)、載體誘導(dǎo)復(fù)制及促進(jìn)產(chǎn)物分泌等。 1什么是基因診斷？基因診斷中常用的方法有哪些？試簡述其中一種方法的原理。 基因診斷是指用分子生物學(xué)的技術(shù)對引起疾病的原因 —— 遺傳基因、致病微生物和寄生蟲 ,以及某些惡性腫瘤在基因水平上進(jìn)行病原學(xué)和細(xì)胞遺傳基因的檢測和分析。基因診斷中常用的方法有核酸分子雜交、 PCR、 DNA芯片技術(shù)、限制酶酶譜分析和 DNA序列測定等。 核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方法之一。它的基本原理是：互補的核酸單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成 雙鏈，即能夠進(jìn)行雜交。它不僅能在 DNA和 DNA之間進(jìn)行，也能在DNA和 RNA之間進(jìn)行。因此，當(dāng)用一段已知基因的核酸序列作探針，與變性后的單鏈基因組 DNA接觸時，如果兩者的堿基完全配對，它們即互補地結(jié)合成雙鏈，從而表明被測基因組 DNA中含有已知的基因序列。 1名詞解釋：基因探針 基因芯片 蛋白質(zhì)工程 基因探針（ probe） ： 就是一段與目的基因 DNA 互補的帶有能檢測標(biāo)記物的特異核苷酸序列，它可以包括整個基因，也可以僅僅是基因的一部分；可以是 DNA 本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的 RNA。 基因芯片 (gene chip)： 又稱 DNA 芯片，是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段有規(guī)律地排列固定于支持物上，樣品 DNA/ RNA 通過 PCR 擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子，然后按堿基配對原理進(jìn)行雜交，再通過熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，并配以計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測，從而迅速得出所要的信息。 蛋白質(zhì)工程： 是指在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)上 ,借助計算機等輔助設(shè)計來確定某一蛋白質(zhì)分子的改造方案。然后通過基因改造和基因工程技術(shù)獲得新的蛋白質(zhì)分子。 1簡述包含體形成的原因和包含體 蛋白復(fù)性的主要步驟。 重組蛋白在細(xì)菌中表達(dá)時，尤其當(dāng)表達(dá)目的蛋白量超過細(xì)菌體總蛋白量 10%時，會在細(xì)胞內(nèi)與細(xì)菌雜蛋白、核酸等成分聚集成沒有生物活性的直徑 m 的固體顆粒，這種不溶性聚合體即包含體（ inclusion body）。 生成包含體的原因可能有是蛋白質(zhì)合成速度太快，多肽鏈相互纏繞，影響了多肽鏈的正確折疊，導(dǎo)致疏水基團(tuán)外露等。 （包含體的形成有利于防止蛋白酶對表達(dá)蛋白的降解，并且非常有利于分離表達(dá)產(chǎn)物。但包含體形成后，表達(dá)蛋白不具有生物活性，因此必須溶解包含體并對表達(dá)蛋白進(jìn)行復(fù)性 。） 包含體復(fù)性即從伸展態(tài)－中間體－后期中間體－天然態(tài)的過程，操作步驟一般為用超聲波、勻漿等使菌體破碎后，離心得到包含體－加入強蛋白質(zhì)變性劑如 6 ～ 8mol／ L 鹽酸胍或 9～ 10mol／ L 尿素溶解包含體－用透析、稀釋和超濾復(fù)性法等等方法使之正確折疊。 1列表比較大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點。 比較指標(biāo)表 達(dá) 系 統(tǒng)大腸桿菌 酵 母 菌 哺乳動物細(xì)胞 昆蟲細(xì)胞1 ．外源基因表達(dá)水平高 比較高 不高 不高 (家蠶除外 )2 ．培養(yǎng)條件 易 易 難 較難3 ．表達(dá)產(chǎn)物的形式多數(shù)不能分泌，胞內(nèi)形成包含體多數(shù)能分泌，少數(shù)在胞內(nèi)形成包含體，有時產(chǎn)物不均一一般都能分泌 一般都能分泌4 ．表達(dá)產(chǎn)物的糖基化不能糖基化 能糖基化，但糖基化程度與天然產(chǎn)物有差別糖基化好，近似天然產(chǎn)物能糖基化，但糖基化程度與天然產(chǎn)物有差別5 ．產(chǎn)物純化工藝細(xì)胞破壁容易，多數(shù)產(chǎn)物需 “復(fù)性 ” ，工藝較復(fù)雜胞內(nèi)表達(dá)破壁困難；分泌物純化工藝簡單純化簡單 純化較簡單 (家蠶除外 )6 ．生產(chǎn)成本 高，主要化費在純化方面低 高，主要花費在培養(yǎng)條件方面高，主要花費在培養(yǎng)條件方面 (家蠶除外 )7 ．穩(wěn)定性 差 較好 好 較好8 ．難點 復(fù)性 破壁 培養(yǎng) 培養(yǎng) 以下為某同學(xué)作業(yè)答案，供參考 表達(dá)系統(tǒng) 優(yōu)點 缺點 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) （ 1）對大腸桿菌的背景知識，特別是基因表達(dá)調(diào)控的分子 機理有深刻了解； （ 2）是一種安全的基因工程實驗體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體； （ 3）許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實現(xiàn)有效、高水平的表達(dá)； （ 4）大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，易用于批量生產(chǎn)。 （ 1）缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機制，只能表達(dá)克隆的 cDNA,不宜表達(dá)真核基因組 DNA； （ 2）缺乏翻譯后加工機制，許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數(shù)的這類修飾作用在細(xì)菌細(xì)胞中并不存在； （ 3）表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包含體，需作復(fù)性處理； （ 4） 難于表達(dá)大量可溶性蛋白。 酵母表達(dá)系統(tǒng) （ 1）基因背景了解清楚，上游操作簡單，生長迅速，非常適于大規(guī)模發(fā)酵。 （ 2）具有一定的加工及修飾能力：如二硫鍵的正確形成，前體蛋白的水解加工。表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白相同或類似。 （ 3）可將異源蛋白基因與 N末端前導(dǎo)肽等信號肽融合，指導(dǎo)新生肽的分泌，在分泌中可對表達(dá)的蛋白進(jìn)行糖基化修飾，但其修飾糖鏈與高等真核細(xì)胞并不相同。 （ 4）可移去起始甲硫氨酸，避免了作為藥物使用可能引起的免疫反應(yīng)問題。 （ 1）產(chǎn)糖量過多因而損壞蛋白質(zhì)的生物活性、安全性等； （ 2）糖基化修飾與高等 真核細(xì)胞并不相同。 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) （ 1）表達(dá)效率高。重組蛋白的表達(dá)水平最高可達(dá)到細(xì)胞總蛋白的 50％。 （ 2）屬于真核表達(dá)系統(tǒng)。有糖基化作用、脂肪酸酰基化作用、氨基末端乙?；饔靡约傲姿峄欣诒磉_(dá)產(chǎn)物形成天然的高級結(jié)構(gòu)，保持原有的生物活性與功能。 （ 3）桿狀病毒能容納較大的外源基因而不影響其本身的增殖。 （ 4）桿狀病毒屬于昆蟲病毒。具有高度特異的宿主范圍，對脊椎動物和植物均無致病性。病毒重組因失去多角體保護(hù)，在自然界的生存能力很弱，因此比較安全。 （ 5）應(yīng)用晚期多角體蛋白基因啟動子表達(dá)外源基因可 表達(dá)毒性蛋白。 （ 6）桿狀病毒表達(dá)載體通用性廣?？杀磉_(dá)來自病毒、細(xì)菌、真菌、植物和動（ 1）宿主細(xì)胞生長慢、 培養(yǎng)基昂貴、 含有免疫宿主蛋白、 桿狀病毒感染會導(dǎo)致宿主死亡、因此每一輪蛋白合成均需重新感染。 （ 2）昆蟲細(xì)胞內(nèi)的糖基化方式與脊椎動物細(xì)胞內(nèi)的糖基化方式有一定的差異，其糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)多為簡單的不分支結(jié)構(gòu)。 物幾乎所有的蛋白，并且能表達(dá)帶有內(nèi)含子的外源基因。 （ 7）重組桿狀病毒除在體外昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)外源基因外，還能感染昆蟲活體，在體內(nèi)高效表達(dá)外源蛋白。 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) （ 1）產(chǎn)物的抗原 性、免疫原性和功能與天然蛋白質(zhì)最接近，糖基化等后加工最精確。 （ 2）一般會產(chǎn)生正確加工的、有活性的蛋白。 該表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)水平較低、培養(yǎng)基昂貴、生長緩慢、含有過敏物質(zhì)等缺點在實際應(yīng)用過程中較難避免。 1利用基因工程菌生產(chǎn)有哪些特點？有什么優(yōu)勢？常用的宿主菌有哪些？ 基因工程菌帶有外源基因，這些基因可能不穩(wěn)定。丟失外源基因的菌往往比未丟失的菌生長快得多，這樣就會大大降低產(chǎn)物的表達(dá)。為了抑制基因丟失的菌的生長，一般在培養(yǎng)中加入選擇壓力，如抗生素。 基因工程菌的培養(yǎng)一般分兩段。前期是菌體生長，生長到某一 階段，加入誘導(dǎo)因子，誘發(fā)產(chǎn)物表達(dá)。 利用基因工程菌生產(chǎn)的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在目的產(chǎn)物產(chǎn)量高，表達(dá)調(diào)控性好，可根據(jù)目的產(chǎn)物特點構(gòu)建各種表達(dá)系統(tǒng)，等等。 常用宿主 菌有 大腸桿菌 （如 BL21(DE3)plysS 菌株）、 酵母菌 （如 Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae 等） 、 枯草芽孢桿菌 等。 在基因工程菌培養(yǎng)過程中為什么質(zhì)粒會丟失？ （ 1） 分離的不穩(wěn)定性：細(xì)胞分裂過程中，有一個子細(xì)胞沒有獲得質(zhì)粒 DNA 拷貝，并最終增殖成為無質(zhì)粒的優(yōu)勢群體。即在細(xì)胞分裂過程中發(fā)生的質(zhì)粒不平均的 分配，導(dǎo)致質(zhì)粒丟失，亦叫做質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性。 （ 2） 培養(yǎng)體系中因為各種原因使選擇壓力消失，無質(zhì)粒載體細(xì)胞速度快，而含有質(zhì)粒載體的寄主細(xì)胞重了代謝的負(fù)荷，降低了生長的速度，最終體系中前者占多數(shù)。 （ 3） DNA 重組等其他原因 。 2基因工程菌高表達(dá)的障礙是什么？ （ 1） 外源基因的不穩(wěn)定，造成表達(dá)的下降 。 如受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組 DNA 分子的降解等原因。 （ 2） 高生長速率與高表達(dá)之間的矛盾 。 外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長代謝。 （ 3） 乙酸的產(chǎn)生 。 菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝 所能提供的能量時，菌體往往會產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物乙酸，嚴(yán)重影響產(chǎn)物表達(dá)。 （ 4） 蛋白的降解 。 小分子蛋白在大腸桿菌中表達(dá)后不穩(wěn)定，容易被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶降解失活 ，可采用 融合表達(dá) 方式加以解決 。 2與大腸桿菌相比酵母作為宿主菌有什么優(yōu)點？ 酵母菌是 單細(xì)胞低等真核生物，易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作。 與大腸桿菌相比其優(yōu)點為： （ 1） 具有真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后加工的 基本 功能， 如二硫鍵的正確形成，前體蛋白的水解加工 、 糖鏈加工 ； 具有適合于真核生物基因產(chǎn)物正確折疊的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和系統(tǒng) ， 表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白相同或類似。 （ 2） 可 將異源蛋白基因與 N末端前導(dǎo)肽等信號肽融合，指導(dǎo)新生肽的分泌， 分泌外源蛋白質(zhì)到培養(yǎng)液中，利于純化。 （ 3） 可移去起始甲硫氨酸，避免了作為藥物使用可能引起的免疫反應(yīng)問題。 基因工程實驗作業(yè)題 如果電泳結(jié)束后紫外燈下看不到條帶，請分析可能的原因。 （ 1） DNA降解（避免核酸酶污染） （ 2）上樣量不夠 （ 3）光源不合適（ 254nm 透射） （ 4） SYBR GREEN I等染料量過少或漏加 （ 5）膠濃度不合適（根據(jù)目的條帶長度來調(diào)整凝膠濃度，一般 ％左右。 ） （ 6）核酸提取、 PCR 反應(yīng)失誤 等等 上樣緩 沖液的作用 ？ （ 1）螯合 Mg 2＋ ，防止電泳過程中 DNA被降解，一般上樣緩沖液中含 10mmol/l 的 EDTA。 （ 2）增加樣品密度以保證 DNA 沉入加樣孔內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。（在大片段電泳中采用 Ficoll（聚蔗糖），可減少 DNA條帶的彎曲和拖尾現(xiàn)象）。 （ 3）指示劑監(jiān)測電泳的行進(jìn)過程，一般加入泳動速率較快的溴酚藍(lán)指示電泳的前沿，其率約與 300bp 的線狀雙鏈 DNA相同。 請分析 PCR 出現(xiàn)假陰性的可能原因。 PCR 反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，② 引物的質(zhì)量與特異性 ③酶的質(zhì)量 ④ PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。 （ 1） 模板原因：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有 Taq 酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。 （ 2） 酶失活 （ 3） 引物：引物質(zhì)量、兩條引物的濃度是否對稱，避免引物之間形成二聚體等。 （ 4） Mg2+濃度：過高可降低擴(kuò)增特異性，濃度過低則影響 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。 （ 5） 操作原因：反應(yīng)體積的改變，未混勻。 （ 6） 物理原因：變性對 PCR 擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性 （ 7） 靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合。 范文最新推薦 21 工會黨支部工作總結(jié) [工會黨支部工作總結(jié) ] xxxx 年，我們工會黨支部在師直黨工委的正確領(lǐng)導(dǎo)下，認(rèn)真學(xué)習(xí)貫徹 “ 三個代表 ” 重要思想，學(xué)習(xí)黨的十六屆四中全會精神，自覺用 “ 三個代表 ” 重要思想指導(dǎo)工作，進(jìn)一步加強黨支部的建設(shè)，在工作中較好的發(fā)揮了政治核心和戰(zhàn)斗堡壘作用，工會黨支部工作總結(jié)?，F(xiàn)將 xxxx 年的支部工作情況總結(jié)匯報如下。 一、努力加強黨支部的思想建設(shè)、組織建設(shè)和作風(fēng)建設(shè) ：在工會全體黨員中繼續(xù)深入學(xué)習(xí)鄧小平理論和 “ 三個代表 ” 的重要思想。在黨的十六大四中全會召開以后，認(rèn)真學(xué)習(xí)大會的精神和文件，特別是對全會討論通過的《關(guān)于加強中國共產(chǎn)黨執(zhí)政能力建設(shè)的決定》，不僅在支部成員內(nèi)部認(rèn)真學(xué)習(xí)貫徹，而且還在工會全體工作人員中傳達(dá)貫徹學(xué)習(xí)。堅持嚴(yán)肅認(rèn)真地進(jìn)行黨員民主評議工作，切實解決黨支部、黨員中存在的問題和不足，努力提高全體黨員的思想認(rèn)識，為圓滿完成全年的各項工作，提供思想保證。同時開好領(lǐng)導(dǎo)班子民主生活會 ，認(rèn)真征集職工意見，認(rèn)真開展批評與自我批評，找差反思，并進(jìn)行認(rèn)真整改，進(jìn)一步完善領(lǐng)導(dǎo)班子的工作。全年共召開民主生活會 2 次，均取得了良好效果，大家普遍反映心更近了，關(guān)系更融洽了，工作氛圍更加和諧了，團(tuán)隊的力量更加強大