【文章內(nèi)容簡介】 NA 鏈，最后得到這一真核細(xì)胞的各條 mRNA 分子逆轉(zhuǎn)錄而來的雙鏈 cDNA 分子。得到的雙鏈 cDNA 分子與適當(dāng)?shù)妮d體相連后轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞中，經(jīng)過繁殖擴(kuò)增后，就 得到 了以真核細(xì)胞成熟 mRNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄而成的 cDNA 克隆集合，即該細(xì)胞的 cDNA 文庫。同樣， 具備了 cDNA 文庫，就可以采用 DNA 雜交篩選和免疫反應(yīng)篩選等方法獲取所需的目的基因。 三、化學(xué)合成法 化學(xué)合成法是以單核苷酸為原料，在體外采用化學(xué)的方法，按照已知基因序列，先合成單鏈 DNA 片段，再連接成完整的目的基因。 對于分子較大的基因，可以采用基因的半合成法，先合成兩條核苷酸單鏈片段，這兩條鏈的末端有一系列互補(bǔ)的堿基構(gòu)成重疊區(qū)域，在 DNA 聚合酶Ⅰ大片段或逆轉(zhuǎn)錄酶等的催化作用下，以重疊區(qū)域?yàn)橐锖铣蓛蓷l完整的互補(bǔ) DNA 雙鏈；對于分子較小的基因，可以采用基因的全合成法，就是根據(jù)雙鏈基因合成一系列 互相之間具有 4 ～ 6 個(gè)堿基重疊的核苷酸短片段，大約 40 ～ 100bp ，在一定條件下形成 DNA 雙鏈， DNA 雙鏈上都具有缺少的 DNA 片段，利用 DNA 聚合酶Ⅰ和 DNA 連接酶將這些缺少的片段補(bǔ)足并相互連接起來，得到完整的基因序列 ，如圖 2 2 。 化學(xué)合成 法必須預(yù)先知道目的基因或其 mRNA 的一級結(jié)構(gòu)即核苷酸順序， 所以 很少單獨(dú)使用化學(xué)合成法，但化學(xué)合成在接頭、引物等方面已經(jīng)在基因工程中被廣泛應(yīng)用。 四、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR） 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ po ly m eras e chain re ac tio n ， PCR ）是應(yīng)用了熱穩(wěn)定 D NA 聚合酶（ T aqDNA 聚合酶）的特性，寡核苷酸（引物）特異性結(jié)合到單鏈的目的 D NA 分子上，在四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，進(jìn)行 DNA 多聚合反應(yīng)，最后將所需的已知 D NA 片段擴(kuò)增出來的過程。如果已知目的基因的序列，就可以利用 PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)很方便的從 DNA 或 cDNA 獲得目的基因，不必構(gòu)建復(fù)雜的 DNA 文庫或 cDN A 文庫。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)每個(gè)循環(huán)主要包括三個(gè)過程： ( 1) 變性：加熱到一定溫度時(shí)，使目的 DNA 雙鏈 打開形成單鏈；（ 2 ）退火：當(dāng)溫度降低時(shí)，預(yù)先設(shè)計(jì)的一對引物分別與變性后的兩條 D NA 單鏈互補(bǔ)結(jié)合；（三）延伸：當(dāng)上升到一定的溫度時(shí)，在 4 種脫氧核糖核苷三磷酸底物、 Mg2+等存在下， T aqDNA 聚合酶以目的基因（單鏈 D NA ）為模板，催化 D NA 鏈沿 5 ˊ→ 3 ˊ方向逐個(gè)加上核苷酸，與模板 DNA 上的堿基配對，合成新的 DNA 鏈，其后再按變性、退火、延伸三步反復(fù)循環(huán)，新合成的 DNA 在下次循環(huán)中起到模板的作用，每次循環(huán)合成的 D NA 序列就會(huì)擴(kuò)增一倍，如此反復(fù)循環(huán) 30 次左右，即可擴(kuò)增得到目的基因，如圖 2 3 。 第五節(jié) 基因的克隆與檢測 一、基因的克隆 二、重組克隆的篩選與鑒定 一、基因的克隆 （一）基因與載體的連接 （二）重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞 （一）基因與載體的連接 1. 黏性末端連接 2. 平末端連接 3. 人工加尾連接 4. 人工接頭連接 1. 黏性末端連接 利用限制性內(nèi)切酶對 外源 DNA 進(jìn)行切割形成黏性末端，再用同一種限制性內(nèi)切酶 切割載體 DNA 形成相同的黏性末端 ，這種相同的單鏈末端能夠配對形成雙鏈，使外源 DNA 與載體共價(jià)連接形成重組 DNA 分子，如圖 2 4 。 2. 平末端連接 利用某些限 制性內(nèi)切酶切割 DNA 后形成平末端 ， T4DNA 連接酶可將具有平末端的外源 DNA 片段和載體 DNA 平端 片段相連，如果 DNA 具有黏性末端可利用大腸桿菌 DNA 聚合酶大片段（ klenow 片段）補(bǔ)齊單鏈末端或用外切核酸酶水解掉突出的單鏈末端，實(shí)現(xiàn)平端連接，平端連接的優(yōu)點(diǎn)是可連接任何 DNA 的平端，但連接效率 比 黏末端低很多，需要大量的酶和較高的底物濃度，聚乙二醇（ PEG ）可促進(jìn)平末端連接，如圖 2 5 。 3. 人工加尾連接 末端轉(zhuǎn)移酶可催化 DNA 末端添加單核苷酸的反應(yīng)，形成寡聚核苷酸尾巴，鏈的長短可以通過反應(yīng) 條件加以控制，如果當(dāng)外源 DNA 末端添加寡聚 T, 載體 DNA末端添加與 T 互補(bǔ)的寡聚 A ，兩者形成互補(bǔ)黏性末端便可連接起來，如圖 2 6 。 4. 人工接頭連接 這個(gè)方法適合平末端 DNA 與黏性末端載體連接。對于平末端 DNA 借助人工合成的接頭能夠很方便的進(jìn)行連接，接頭指人工合成的一段雙鏈寡核苷酸，含有一個(gè)或幾個(gè)酶切位點(diǎn) 。 在 T4DNA 連接酶的催化下與平末端 DNA 相連，再以相應(yīng)的限制酶切出黏末端，可與黏末端載體相連接，如圖 2 7 。 （二）重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞 1. 生物學(xué)方法 2. 物理學(xué)方法 3. 化學(xué)方法 1. 生物學(xué)方法 （ 1 ）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 如酵母細(xì)胞經(jīng)過適當(dāng)?shù)乃饷该附庀?xì)胞壁處理后，將原生質(zhì)體懸浮在山梨醇和氯化鈣溶液中，在運(yùn)載 DNA 、某些多聚物和二價(jià)離子（ Ca2+、 Mg2+）存在的條件下，在原生質(zhì)表面沉淀成顆粒，這些顆 粒通過原生質(zhì)體的內(nèi)吞作用進(jìn)入受體細(xì)胞中，從而使外源 DNA 導(dǎo)入到受體細(xì)胞中 。 （ 2 ）噬菌體轉(zhuǎn)染法 重組的 λ 噬菌體在體外重裝成有感染力的 λ 噬菌體顆粒后 ，通過 受體細(xì)胞表面 λ 噬菌體接受位點(diǎn)使重組 DNA 導(dǎo)入到受體細(xì)胞中。 （ 3 ）病毒轉(zhuǎn)染法 首先將病毒與外源 DNA 重組并包裝成完整的病毒顆粒，在適合的條件下感染細(xì)胞，使外源 DNA 導(dǎo)入到受體細(xì)胞中。 2. 物理學(xué)方法 （ 1 ）顯微注射法 該法 是一種利用非常細(xì)的玻璃管攜帶裸露的 D NA ，在顯微鏡下直接將外源 DNA 注射到受體細(xì)胞當(dāng)中的方法。 （ 2 ）電穿孔法 將外源 DNA 與受體細(xì)胞混合放入電擊儀的特殊裝置中，加以高壓短時(shí)脈沖電場作用，由于細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，電擊后會(huì)產(chǎn)生瞬時(shí)可自動(dòng)修復(fù)的小孔，使外源 DNA 進(jìn)入受體細(xì)胞中。 （ 3 ）基因槍法 首先用 CaCl亞精氨酸等將 DNA 沉淀，然后將外源 DNA 包被在微小的金?；蜴u粒表面，在利用基因槍以火藥爆炸的壓力或以壓縮液氮為動(dòng)力將包被有外源 DNA 的微粒以高速射入受體細(xì)胞中，使外源 DNA 導(dǎo)入受體中。 3. 化學(xué)方法 最常用的將外源 DNA 導(dǎo)入受 體細(xì)胞中的化學(xué)方法為磷酸鈣沉淀法，此法是將外源 DNA 與一定濃度的 CaCl2混合 后， 放入含有受體細(xì)胞的磷酸緩沖液中，形成DNA Ca3（ PO4）2微細(xì)沉淀顆粒，這些微細(xì)顆?？筛患谑荏w細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，通過胞飲活動(dòng)被攝入細(xì)胞，使外源 DNA 導(dǎo)入受體細(xì)胞中。 二、重組克隆的篩選與鑒定 （一）利用表型特征進(jìn)行篩選 （二）重組 DNA電泳檢測 （三）內(nèi)切酶圖譜鑒定 （四）利用核酸雜交進(jìn)行鑒定 （五）利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR）技術(shù)鑒定 （六）免疫沉淀檢測法 （七） DNA序列分析 （一）利用表型特征進(jìn)行篩選 1. 抗藥性標(biāo)志的篩選 2. β半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選 3. 利用噬菌斑的形成進(jìn)行篩選 1. 抗藥性標(biāo)志的篩選 外源 DNA 插入帶有抗藥性選擇標(biāo)記基因的載體，使載體的這種抗藥性喪失，利用這一特點(diǎn)進(jìn)行篩選。如 PB R 3 2 2 載體含有 Am pr和 T e tr基因，如果在 T e tr基因選擇一個(gè)酶切點(diǎn)，插入外源 DNA ，就會(huì)使抗四環(huán)素基因失活，這時(shí)，含有外源DNA 的受體細(xì)胞可以在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生長，同理，外源 DNA 插入 Am pr基因中的酶切點(diǎn)，受體細(xì)胞只能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長，不能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，這樣就會(huì)很容易區(qū)別轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，單純載體細(xì)胞和重組載體（含外源基因）細(xì)胞。 2. β半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選 許多噬菌體 DNA 或質(zhì)粒帶有一個(gè)半乳糖苷酶基因 LacZ ，這一基因 的 表達(dá)產(chǎn)物為 β 半乳糖苷酶，在誘導(dǎo)物 IPTG （異丙基硫代半乳糖苷）存在下，能催化 x gal（ 5 溴 4 氯 3 吲哚 β D 半乳糖苷）形成藍(lán)色復(fù)合物（ 5 溴 4 氯靛藍(lán)），當(dāng)外源DNA 插入后， 破壞 了 β 半乳糖苷酶基因 LacZ 的編碼序列， 從而不 產(chǎn)生 半乳糖苷酶，在含有 IPTG 誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中就無法催化底物 x gal 產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，菌落 因此 呈白色，而無重組子的菌落呈藍(lán)色。