第二章基因工程工具酶(簡化版)(編輯修改稿)
2024-11-19 22:12 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 逆轉(zhuǎn)錄酶類，以RNA作為聚合模板,根據(jù)模板和作用方式的不同分為三類：,?,二、大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）,性質(zhì): ①5’→3’ DNA聚合酶活性 ②3’→5’外切核酸酶活性 ③5’→3’外切核酸酶活性,?,三、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段 （Klenow片段）,性質(zhì) 它具有5’→3’聚合活性和3’→5’外切酶活性,失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性.,?,四、T4噬菌體DNA聚合酶,性質(zhì) 具有5’→3’聚合酶活性及3’→5’外切核酸酶活性。其3’→5’外切酶活性對單鏈DNA的作用比對雙鏈DNA的作用更強。它的外切核酸酶活性比kenow片段要強200倍。,用途 1）補平或標記限制性內(nèi)切酶消化DNA后產(chǎn)生的3’凹端。 2）對帶有3’突出端的DNA分子進行末端標記。,?,五、T7噬菌體DNA聚合酶,性質(zhì) 持續(xù)合成能力最強 3’→5’外切核酸酶活性為klenow片段的1000倍 沒有5’→3’外切酶活性。 主要用途 1）用于拷貝長段模板的引物延伸反應。 2）通過補平或交換（置換）反應進行快速末端標記。,?,六、Taq DNA聚合酶,具有5’→3’外切核酸酶活性。最佳作用溫度為7580℃。無3’ → 5’外切核酸酶活性，糾錯功能較差。 用途 1）可使特定序列擴增106倍。 2）用于聚合酶鏈式反應（PCR），對DNA片段進行體外擴增。,?,七、逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase） 依賴于RNA的DNA聚合酶,商品化逆轉(zhuǎn)錄酶： ①禽源反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）， ②鼠源反轉(zhuǎn)錄酶（Mo—MLV）,反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈 雙向外切DNARNA雜合鏈中的RNA鏈,?,第四節(jié) PCR反應及應用,PCR（Polymerase Chain Reaction） 稱為聚合酶鏈反應或PCR擴增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序。具有特異性強、靈敏度高、簡便快速、對標本的純度要求低等特點。,?,變性 94?C,延伸 72?C,退火 Tm5?C,基本反應步驟,?,PCR技術(shù)的特點 高特異性 高靈敏度 簡便快速 低純度標本也可使用,?,第五節(jié) DNA連接酶（ligase）,?,DNA連接酶：將兩個DNA片段通過催化形成3’，5’－磷酸二酯鍵而連接起來的酶。 T4 DNA連接酶：可連接DNA鏈（平粘端
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