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正文內(nèi)容

基因工程操作的工具酶(編輯修改稿)

2025-02-02 02:22 本頁面
 

【文章內(nèi)容簡介】 TCC3)與 BglⅡ (5A↓GATCT3)的酶切片段可以彼此連接起來 。 :來自不同物種,但是識別序列和酶切位點均相同。 ? 例如: HpaⅠ 5GTT’AAC3; HincⅡ 酶切GTY’RAC 核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì) 高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端 pH值等, 會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性,即所謂的星活性( Star activity)現(xiàn)象 . EcoR I在正常條件下識別并切割 5’GAATTC3’序列,但在甘油濃度超過 5%( v/v)時,也可切割 5‘PuPuATPyPy3’或者 5‘AATT3’ 大腸桿菌中的甲基化酶 dam甲基化酶 : 可在 5 ’ GATC3’序列中的腺嘌呤 N6位置上引入甲基。 dcm甲基化酶 此酶在序列 539。CCAGG339?;?539。CCTGG339。中的胞嘧啶C5上引入甲基,受其影響的限制性內(nèi)切酶是EcoR II。 3’-腺嘌呤脫氧核苷酸 (3’- d AMP ) H O H O P O CH2 O O H H H NH2 N H N N CH N 9 HO N O N H C CH3 NH2 5’-胞嘧啶核苷酸 (5’- CMP ) H O H O P O CH2 O O H H OH OH 甲基化酶在基因工程中用途 : 許多 II類限制性內(nèi)切酶,都存在著相對的甲基化酶,它們可修飾限制酶識別順序中的第三位腺嘌呤上,封閉酶切位點,從而使其免受切割。 Ⅱ 型限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件 在合適的溫度和緩沖液中,在 20μl反應(yīng)體系中, 1 h完全降解 1μgDNA所需要的酶量,稱為一個單位的限制性核酸內(nèi)切酶。 酶過量可導(dǎo)致識別序列的特異性下降 。 應(yīng)注意的問題 1濃縮的酶液要稀釋(不能用水) 2 低溫保存 一 20℃ 穩(wěn)定保存 影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 (1).DNA的純度 。 DNA制劑中的其他雜質(zhì),如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉 (SDS)以及高濃度的鹽離子等,都有可能抑制限制性核酸內(nèi)切酶的活性。 (2).DNA的甲基化程度 。 內(nèi)切酶不能夠切割甲基化的核苷酸序列 。 通常使用喪失了甲基化酶的大腸桿菌菌株制備質(zhì)粒 DNA。 若要使用合成的銜接物修飾 DNA片段的末端,被酶切之前,通過甲基化將內(nèi)部的限制酶識別位點保護起來。 ( 3)酶切反應(yīng)的溫度 。 大多數(shù)限制性核酸內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度是37℃ ,但 SmaⅠ 是 25℃ , ApaI是 30℃ ( 4) DNA的分子結(jié)構(gòu)。 超螺旋的質(zhì)粒 DNA所需要的酶量要比消化線性的 DNA高達 20倍 。 ( 5)限制性核酸內(nèi)切酶的緩沖液。 標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的組分包括: 氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、 Tris—HCl、 β一巰基乙醇或二硫蘇糖醇 (DTT)以及牛血清白蛋白 (BSA)等。 酶活性需要 2價陽離子,通常是 Mg2+。 3. DNA聚合酶 分為兩類: ①依賴于 DNA的 DNA聚合酶,包括大腸桿菌DNA聚合酶 I(全酶)、大腸桿菌 DNA聚合酶 I的 Klenow大片段酶、 T4 DNA聚合酶、T7DNA聚合酶和耐高溫的 DNA聚合酶等。 ②依賴于 RNA的 DNA聚合酶,有逆轉(zhuǎn)錄酶。 DNA聚合酶 (1)大腸桿菌 DNA聚合酶 I ( DNA pol I): 也稱為 Kronberg酶,是 Kronberg等 1956年發(fā)現(xiàn)的第一個 DNA聚合酶。 具有三種酶活性 a、 5’ 3’DNA聚合酶活性 CCGATAOH DNA pol I CCGATAGCCT GGCTATCGGA Mg2+ dNTP GGCTATCGGA b、 3’ 5’ 外切酶活性 CGCATCGOH DNA pol I CGC ATCG GCG Mg2+ dNTP GCG 校正作用。 c、 5’ 3’外切酶活性 CGCATTAG DNA pol I CATTAG GCGTAAT
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