【文章內(nèi)容簡介】 3. 通常延長時間可使所需的酶量減少，在切割大量 DNA時可用。 4. 注意 星號酶切活力 。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 六、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 （一）酶的純度 （二） DNA樣品的純度 DNA樣中混有蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、 EDTA、SDS、 NaCl等 ， 都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性： ?加大酶的用量， 1μg DNA用 10U酶 ?加大反應(yīng)總體積 ?延長反應(yīng)時間 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 六、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 （三） DNA樣品的甲基化程度 采用去甲基化酶的大腸桿菌菌株來制備質(zhì)粒 DNA，可防止 DNA的甲基化。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 六、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 （四）酶切反應(yīng)的溫度與時間 多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度是 37℃ ，如 SmaI為 25℃ 或 30℃ ， SfiI為 50℃ 。 反應(yīng)溫度過度或過低都會影響酶活性，甚至導(dǎo)致酶失活。 酶解時間可通過加大酶量而縮短，反之酶量較少時，可通過延長酶解時間以達(dá)到完全酶解 DNA的目的。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 六、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 （五） DNA的分子構(gòu)型 某些酶切割超螺旋質(zhì)粒 DNA時，酶量比切割線性 DNA時高出多倍，可高達(dá) 20倍。 酶 最適溫度 oC 酶 最適溫度 oC 酶 最適溫度 oC Apa I Bcl I Mae II Taq I 30 50 50 65 Apy I BstE II Mae III 30 60 55 Ban I Mae I Sma I 50 45 25 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 六、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 （六）限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液 高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端 pH值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的 “ 星活性 ” （ star activity） 現(xiàn)象。 EcoRI*代表 EcoRI的星號活力。 星活性的特點 : 限制酶識別序列特異性降低 例如： EcoRI（高 pH值或低鹽離子強度） 5’G AATTC3’變成 5’N AATTN3’，另有一種情況是對AATT中的 A、 T分辨不嚴(yán)格 商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 發(fā)生星反應(yīng)的限制酶和條件 1)反應(yīng)體系中甘油含量過高（ 5%， V/V），應(yīng)使用能完全酶切DNA的最小酶量避免這種情況的發(fā)生； 2)限制酶用量過大（ 100U/ug DNA）； 3)低離子濃度（ 50mmol/ml）； 4)高 pH（ ） 5)含有有機溶劑（如二甲基亞砜、乙醇、二甲基乙酰胺等）； Mn2+、 Cu2+、 Co2+、 Zn2+等非 Mg2+的二價陽離子存在。 6)不同的限制酶出現(xiàn)的星號活力的閾值也不一樣，常易發(fā)生星號活力的酶有： EcoR I、 Hind III、 Kpn I、 Pst I、 Sca I、 Sal I、 Hinf I等。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 抑制星號活性的方法 1)盡量用較少的酶進(jìn)行完全消化反應(yīng)。這樣可以避免過度消化以及過高的甘油濃度。 2)盡量避免有機溶劑（如制備 DNA時引入的乙醇）的污染。 3)將離子濃度提高到 100150 mM（若酶活性不受離子 強度影響）。 4)將反應(yīng)緩沖液的 pH值降到 。 5) 二價離子用 Mg2+。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用： 重組 DNA前的切割 構(gòu)建新質(zhì)粒 構(gòu)建物理圖譜 DNA分子雜交 用限制性內(nèi)切酶消化受體 DNA 制備 DNA探針 亞克隆以用作序列分析 基因定位， DNA同源性研究 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 本節(jié)重點掌握的內(nèi)容 限制性核酸內(nèi)切酶、同裂酶、同尾酶、星星活性。 II型限制性核酸內(nèi)切酶命名原則、操作注意事項及產(chǎn)生星活性的原因、影響酶活性的因素。 生命科學(xué)學(xué)院 第二節(jié) DNA連接酶 剪刀 — 限制性內(nèi)切酶 針線、膠水 — 連接酶 生命科學(xué)學(xué)院 第二節(jié) DNA連接酶 DNA連接酶 生命科學(xué)學(xué)院 第二節(jié) DNA連接酶 一、概念與機理 DNA連接酶是 1967年在三個實驗室同時發(fā)現(xiàn)的。它是一種能夠?qū)?DNA鏈上彼此相鄰的 3’羥基（ OH ）和 5’磷酸基團（ P），在 NAD+或 ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。大腸桿菌和其他細(xì)菌的 DNA連接酶以 NAD+作為能量來源，動物細(xì)胞和噬菌體的連接酶則以 ATP作為能量來源。 生命科學(xué)學(xué)院 第二節(jié) DNA連接酶 一、概念與機理 DNA連接酶只能連接 缺口（ nick）， 不能連接 裂口（ gap） 。而且被連接的 DNA鏈必須是雙螺旋 DNA分子的一部分。 注意：缺口（或稱切口）和裂口的區(qū)別?。。。?！ 注：關(guān)于“ Gap”與“ Nick”的概念。 ：即 DNA裂口，是指雙鏈 DNA分子上的某一條鏈?zhǔn)ヒ粋€或數(shù)個核苷酸時所出現(xiàn)的 DNA單鏈斷裂。 Gap in DNA is the absence of one or more nucleotides in one strand of duplex. ：即雙鏈 DNA分子的單鏈斷裂，即在相鄰的 2個核苷酸分子之間，失去了 (移走了 )一個磷酸二酯鏈。 Nick in duplex DNA is the absence of a phosphodiester bond between two adjacent nucleotides on one strand. 生命科學(xué)學(xué)院 第二節(jié) DNA連接酶 DNA連接酶對不同 DNA分子的連接作用 生命科學(xué)學(xué)院 第二節(jié) DNA連接酶 二、 DNA連接酶的種類 （一） T4噬菌體 DNA連接酶 特點： 只連接 ds DNA分子，要求 3’羥基和 5’磷酸基 用途： 1) 粘性末端的連接 2) 平頭末端的相連 抑制劑 : PO435mM , NaCl25mM, Ca2+ 生命科學(xué)學(xué)院 第二節(jié) DNA連接酶 二、 DNA連接酶的種類 (二）大腸桿菌 DNA連接酶 連接具粘性末端 DNA分子，以 NAD作輔助因子 (三）熱穩(wěn)定 DNA連接酶 以 NAD為輔助因子，優(yōu)先作用于缺口 連接酶使用注意事項 1)DNA連接酶不能催化兩 單鏈 DNA分子 連接； 2)只能連接雙鏈 DNA分子的 單鏈切口 (nick)； 3)不能連接雙鏈中一個或多個核苷酸缺失所致的 缺口（ gap） 。 DNA連接酶的部分性質(zhì) 連接酶 底物 輔助 因子 巰基 試劑 粘性末端 平末端 DNARNA 雜合體 RNARNA 雜合體 大腸桿菌 DNA 連接酶 可行 可行 不行 不行 NAD+ Mg2+ 不需要 T4DNA 連接酶 可行 可行 可行 可行 ATP Mg2+ 需 DTT 噬熱菌 DNA 連接酶 可行 不行 不行 不行 NAD+ Mg2+ 需要 生命科學(xué)學(xué)院 第二節(jié) DNA連接酶 DNA連接酶應(yīng)用圖解 （一）分子間的連接 （二）分子內(nèi)的連接 生命科學(xué)學(xué)院 第二節(jié) DNA連接酶 三、 DNA連接酶的反應(yīng)體系 四、影響連接反應(yīng)的因素 1. 插入片段與載體的濃度比例： 210:1 增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象 2. 反應(yīng)溫度：一般 4~16℃ 3. ATP濃度 10 T4 DNA Ligase Buffer 1μl pMD18T（ 30ng/μl） 1μl 已純化的 PCR產(chǎn)物 Xμl* T4 DNA Ligase 2~3Weiss Units ddH2O 至 10μl 生命科學(xué)學(xué)院 第二節(jié) DNA連接酶 平末端 DNA片段的連接 (補充 ) 生命科學(xué)學(xué)院 第二節(jié) DNA連接酶 平末端 DNA片段的連接 (補充 )