【文章內(nèi)容簡介】 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） 七、使用限制酶的注意點(diǎn) ①小心取用，節(jié)省開支 ； ②操作要盡可能快，用完后立即將酶放回冰箱，以使酶在冰箱外放置的時間盡可能縮短 ； ③盡量減少反應(yīng)中的加水量以使反應(yīng)體積減到最小 ； ④通常延長消化時間可使所需的酶量減少 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） 八、 DNA分子片段化 單酶切法 雙酶切法 部分酶切法 ? 現(xiàn)有一長度為 1000 堿基對（ bp）的 DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶 Eco R1酶切后得到的 DNA分子仍是 1000 bp，用Kpn1單獨(dú)酶切得到 400 bp和 600 bp兩種長度的 DNA分子，用 EcoRI、 Kpnl同時酶切 后得到 200 bp和 600 bp兩種長度的DNA分子。 第二節(jié) DNA連接酶 一、 DNA連接酶的發(fā)現(xiàn) ? 1967年，世界上有多個實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r而且獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)。 ? 1974年以后，科學(xué)界正式肯定了這一發(fā)現(xiàn)，并把這種酶叫作 DNA連接酶。 第二節(jié) DNA連接酶 二、 DNA連接酶的連接機(jī)理 (演示 ) ? 一種封閉 DNA鏈上缺口酶，借助 ATP或NAD水解提供的能量催化 DNA鏈 539。PO4與另一 DNA鏈的 339。OH生成 磷酸二酯鍵 。 ? 如果是兩個或兩個以上不同的雙鏈 DNA片段末端連接，則產(chǎn)生重組 DNA分子。 第二節(jié) DNA連接酶 三、常用的 DNA連接酶 E. coli DNA連接酶 ? 催化片段 互補(bǔ)黏性末端 之間的連接 ? 以 NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，是一種轉(zhuǎn)遞電子的輔酶）作為輔助因子 第二節(jié) DNA連接酶 三、常用的 DNA連接酶 T4 DNA連接酶 ? 不僅能催化片段 互補(bǔ)黏性末端 之間的連接，也能催化雙鏈 DNA平末端 之間的連接 ? 以 ATP（腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷）作為輔助因子 第二節(jié) DNA連接酶 三、常用的 DNA連接酶 Tsc DNA連接酶 ? 一種能夠在 高溫 下催化兩條 寡核苷酸探針發(fā)生連接作用 的核酸酶 ? 連接酶鏈反應(yīng)（ ligase chain reaction，LCR） 第二節(jié) DNA連接酶 四、 DNA片段的連接方法 互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接 ? 既可用 大腸桿菌 DNA連接酶 ，也可用 T4 DNA連接酶 ? 同種限制酶 切開連接后 保留原有切點(diǎn) ； 同尾酶 切開連接后 失去原有的兩種限制性酶的識別序列 第二節(jié) DNA連接酶 四、 DNA片段的連接方法 平末端片段之間的連接 ? 只能用 T4 DNA連接酶 ，但要增加酶用量 ? 同種限制酶 切開連接后 保留原有切點(diǎn) ； 同尾酶 切開連接后 失去原有的兩種限制性酶的識別序列 ? 有的新連接片段還可能形成新的限制酶切位點(diǎn) 第二節(jié) DNA連接酶 四、 DNA片段的連接方法 片段末端修飾后進(jìn)行連接 ? DNA片段末端同聚物加尾后連接 ? 黏性末端修飾成平末端后連接 ? DNA片段 5‘端脫磷酸化作用后連接 ? DNA片段加連桿后連接 DNA片段末端 同聚物加尾 后進(jìn)行連接 黏性末端修飾成平末端 后進(jìn)行連接 DNA片段 5‘端脫磷酸化 作用后連接 DNA片段 加連桿 后連接 ? 寡核苷酸連桿（ linker） 是一種按預(yù)先設(shè)計化學(xué)合成的寡核苷酸片段，一般由 812個核苷酸組成，具有 一個或數(shù)個限制酶識別位點(diǎn) 的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。 DNA片段 加連桿 后連接 ? 設(shè)計合成的另一類寡核苷酸連桿由幾十至上百個核苷酸組成，有多種限制酶的識別序列，可作為連桿且被組裝在克隆載體上成為 多克隆位點(diǎn)（ MCS） ，這種連桿即多克隆位點(diǎn)寡核苷酸連桿或簡稱 MCS連桿 。 DNA片段 加連桿 后連接 ? 銜接頭（ adaptor） 是一類人工合成的一類具有一種以上的限制酶粘性末端的寡核苷酸短片段。 ? 與連桿的重要區(qū)別是合成的 銜接頭的一端或兩端已具有一種或兩種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端 。 第三節(jié) DNA聚合酶 ? DNA聚合酶以 DNA為復(fù)制模板，從 DNA由 5?端點(diǎn)開始復(fù)制到 3‘端的酶。 ? 常用的 DNA聚合酶有：耐熱性 DNA聚合酶、大腸桿菌 DNA聚合酶 I、 Klenow酶、T4 DNA聚合酶等。 第三節(jié) DNA聚合酶 一、大腸桿菌 DNA聚合酶 I 第三節(jié) DNA聚合酶 一、大腸桿菌 DNA聚合酶 I 5′→ 3′的聚合酶活性 ① dNTPs（ dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP）和 Mg2+離子 ②帶有 3′OH游離基團(tuán)的引物鏈 ③ DNA模板，它可以是單鏈的，也可以是雙鏈的 第三節(jié) DNA聚合酶 一、大腸桿菌 DNA聚合酶 I 5′→3′的核酸外切酶活性 ①從 DNA鏈的 5′端向 3′末端水解已配對的核苷酸，切斷磷酸二酯鍵，每次能切除 10個核苷酸 ②通過 DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的 DNA探針 第三節(jié) DNA聚合酶 一、大腸桿菌 DNA聚合酶 I 3′→5′的核酸外切酶活性 ※ 從 3′→5′方向識別并切除 DNA生長鏈末端與模板 DNA不配對而游離的核苷酸 第三節(jié) DNA聚合酶 二、 Klenow片段 ※ 大腸桿菌 DNA聚合酶 Ⅰ 大片段（ klenow 片段），又叫做 Klenow聚合酶 或 Klenow大片段酶 ※ 作為商品提供的 klenow片段是用 枯草桿菌蛋白酶裂解 完整的 DNA聚合酶 Ⅰ 而產(chǎn)生或者通過 克隆技術(shù) 而得到的單一多肽 ? Klenow聚合酶的主要用途 ① 補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切割 DNA產(chǎn)生的 3′凹端； ② 用 [32P]dNTP補(bǔ)平 3′凹端 ， 對 DNA片段進(jìn)行末端標(biāo)記； ③ 對帶 3′突出端的 DNA進(jìn)行末端標(biāo)記； ④ 在 cDNA克隆中 ， 合成 cDNA第二鏈； ⑤ 在體外誘變中 ， 從單鏈模板合成雙鏈 DNA； ⑥ 應(yīng)用雙脫氧鏈末端終止法進(jìn)行 DNA測序 。 ⑦ 也用于 PCR反應(yīng)進(jìn)行體外擴(kuò)增基因 DNA序列 ， 但已經(jīng)被 Taq DNA聚合酶代替 。 第三節(jié) DNA聚合酶 三、 T4 DNA聚合酶 ※ 從一種攜帶有高表達(dá) T4 DNA聚合酶質(zhì)粒的大腸桿菌中提純制備 ※ 具有 5′→3′聚合酶活性及 3′→5′外切核酸酶活性 ? T4 DNA聚合酶的主要用途 ① 補(bǔ)平或標(biāo)記限制性內(nèi)切酶消化 DNA后產(chǎn)生的 3′凹端 ， ② 對帶有 3′突出端的 DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記； ③ 標(biāo)記用作探針的 DNA片段 。 ④ 將雙鏈 DNA的末端轉(zhuǎn)化成為平端 ， ⑤ 使結(jié)合于單鏈 DNA模板上的誘變寡核苷酸引物得到延伸 。 外切酶活性 聚合酶活性 無 dNTP dNTP 5’CAGCAACGT 3’ dATP CAGCAACGT 3’ S1 T 3’ 3’GTCGTTGCA 5’T4聚合酶 A 5’ A 5’ 第三節(jié) DNA聚合酶 四、耐熱 DNA聚合酶 ※ 從嗜熱的水生菌 Thermus aquaticus中純化來的，現(xiàn)在以基因工程生產(chǎn)并出售（ AmpliTaqTM） ※ 分為三類：普通耐熱 DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、 DNA序列測定耐熱 DNA聚合酶 ? 耐熱 DNA聚合酶的主要用途 ① DNA測序 ② 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （ PCR） 對 DNA片段進(jìn)行體外擴(kuò)增 第三節(jié) DNA聚合酶 五、逆轉(zhuǎn)錄酶 ※ 又稱 RNA 指導(dǎo)的 DNA 聚合酶，是以 RNA 為模板合成 DNA的酶 ※ 有兩種已經(jīng)商品化：一種來自純化的 成骨細(xì)胞性白血病病毒（ AMV） ；另一種是來自 Moloney鼠白血病病毒（ MoMLV） 。 ? 逆轉(zhuǎn)錄酶的主要用途 ① 以 mRNA為模板合成 cDNA ， 是反轉(zhuǎn)錄酶的最主要的用途 ② 利用其 5?→3‘外切酶活性 ， 標(biāo)記帶 5?突出末端的 DNA片段 ③ 當(dāng)其他酶用于雙脫氧鏈終止法測序效果不理想時 ， 則可試用反轉(zhuǎn)錄酶 5’ AAAAA3’ 引物 5’ AAAAA 3’ TTTTT 5’ 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 全長 cDNA 提前終止反應(yīng) 第四節(jié) DNA修飾酶 一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 ※ 簡稱末端轉(zhuǎn)移酶 ，能夠催化 5′脫氧核苷三磷酸進(jìn)行 5′→ 3′方向的聚合作用 ※ 不需要模板存在就可以催化 DNA分子發(fā)生聚合作用 第四節(jié) DNA修飾酶 二、堿性磷酸酯酶 ※ 細(xì)菌堿性磷酸酶（ bacterial alkaline phosphatase，簡稱 BAP）；小牛腸堿性磷酸酶（ calf intestinal alkaline phosphatase，簡稱 CIP） ※ 使 DNA（或 RNA）片段的 5′P末端轉(zhuǎn)換成