基因工程載體bppt課件(編輯修改稿)
2024-10-08 18:25 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 DNA（replicationformDNA,RFDNA）， 可以象質(zhì)粒 DNA那樣在體外進(jìn)行純化和操作。 ? 成熟的噬菌體顆粒僅能感染 F+細(xì)胞（噬菌體的感染位點在性散毛上）。但 RF DNA或 ss DNA都能轉(zhuǎn)染 F+或 F細(xì)胞。 ? 噬菌體顆粒的大小是受其 DNA的大小制約的（正好與 λ噬菌體 相反），因此它不存在包裝限制問題。M13噬菌體kb單鏈環(huán)狀正鏈 DNA基因組作載體的優(yōu)點： 1) RF DNA 和 SS DNA都可轉(zhuǎn)染 ，產(chǎn)生噬菌斑； 2) 無包裝限制問題（可 6倍于 M13基因組）； 3) 復(fù)制以雙鏈環(huán)形 DNA為中間媒介； 4） 易測出外源 DNA的插入方向； 5） 可產(chǎn)生能直接測序的單鏈 DNA分子。構(gòu)建 M13噬菌體克隆載體的策略和途徑詳見第二版 P116噬菌粒載體（ phagemid vector)由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的載體系統(tǒng)，稱為噬菌粒（ phagemid或 phasmid）噬菌體 質(zhì)粒 單鏈?zhǔn)删w輔助噬菌體 大腸桿菌寄主菌株pEMBL8 pUC8 f1 IR1 71/18pRSA101 πVX M13 M13變 異株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13 M13K07 MV1184pBS pUC f1 M13K07 XLBlue幾種常用的噬菌粒載體的一般特征pUC119(MCS)pUC118(MCS)puC118和pUC119噬菌粒載體的分子結(jié)構(gòu)噬菌粒載體的特點（ 1）具小分子量的共價、閉合、環(huán)狀的基因基因組 DNA， 可克隆高達(dá) 10 kb的外源 DNA；拷貝數(shù)高；（ 2）有 ampr 等基因作為選擇記號；可用組織化學(xué)顯色反應(yīng) 篩選重組子；存在多克隆位點；（ 3）具質(zhì)粒復(fù)制起點， 在無輔助噬菌體存在下 ，克隆外源 基因可按質(zhì)粒一樣復(fù)制；（ 4）有單鏈?zhǔn)删w復(fù)制起點， 在有噬菌體輔助感染的宿主 細(xì)胞中 ，可合成出單鏈 DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆粒 分泌到培養(yǎng)基中。（ 5）可直接對克隆的基因進(jìn)行核苷酸測序? CaMV(花椰菜花葉病毒 )載體系統(tǒng)：雙鏈 DNA病毒? TMV(煙草花葉病毒 )載體系統(tǒng)： 單鏈 RNA病毒? 其他植物病毒載體系統(tǒng)，如 單鏈 DNA病毒 ：番茄金黃花葉病毒、非洲木薯花葉病毒、玉米線條病毒、小麥矮縮病毒，以及 RNA病毒 ：雀麥草花葉病毒、大麥條紋花葉病毒、番茄叢矮病毒等等。植物病毒載體? 花椰菜花葉病毒 (caulimovirus， CaMV)：實際上是一個病毒群，已知有 12個種。該病毒是為數(shù)不多的植物雙鏈 DNA病毒之一。 每個種的寄主范圍都很窄， 不感染豆類和單子葉植株， 它的 寄主主要是十字花科植物（集中在蕓苔屬）和少數(shù)非十字花科（如茄科）植物 。? CaMV DNA的特征： 在病毒顆粒中， CaMV DNA分子以開環(huán)形式存在，兩條鏈的一定位置出現(xiàn)核苷酸序列不連續(xù)的缺口（負(fù)鏈： 1個，即 G1；正鏈： 2個，即 G2和 G3）。CaMV(花椰菜花葉病毒 )載體系統(tǒng)構(gòu)建 CaMV載體的基本策略? 自然條件下， CaMV感染宿主后，其 DNA可以侵入植物細(xì)胞，但不插入染色體 DNA，而是在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，但其結(jié)果是導(dǎo)致植物的病害。根據(jù)此特征，構(gòu)建載體的基本策略是：? 合理利用 CaMV DNA能侵入植物細(xì)胞的特性 ，可以將外源基因?qū)胫参矬w內(nèi)，但需要 消除 CaMV對植物的致病性 。? 詳見 第二版 P130◆ 質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿足動物 DNA重組的需要。 能感染動物的病毒可改造為動物細(xì)胞的載體病毒載體多為穿梭載體：動物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費較多動物病毒載體◆ 常用病毒載體 : 改造來自猴腎病毒 SV40（ Simian Virus 40） 、 逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒 和 昆蟲桿狀病毒 等目的 : 將目的基因或序列放入動物細(xì)胞中表達(dá)或試驗其功能、或作基因治療等 SV40病毒 ? SV40病毒呈小型 20面體，環(huán)狀 DNA， 外殼蛋白由 VP VP VP3構(gòu)成。? 基因結(jié)構(gòu)– 早期表達(dá)區(qū)編碼 大 T抗原和小 t抗原 （即腫瘤蛋白質(zhì)或抗原）。 T抗原的功能是控制 SV40基因組的復(fù)制和調(diào)節(jié)。小 t抗原的功能不詳– 晚期表達(dá)區(qū)合成 Vp Vp Vp3（ 外殼蛋白 ）， 包裝釋放? 受納細(xì)胞 （ permissive cell） ： 病毒感染宿主細(xì)胞后，使細(xì)胞裂解，并釋放感染性病毒顆粒。? 非受納細(xì)胞 （ non permissive cell）： 不產(chǎn)生感染性病毒顆粒，而病毒 DNA整合到細(xì)胞染色體中產(chǎn)生癌變。? 半受納細(xì)胞 （ semipermissive cell） :只有部分被感染的細(xì)胞會裂解產(chǎn)生出感染性的病毒顆粒。 (1)取代型 基因載體 ? 取代型基因載體 特點：外源 DNA直接插入在缺陷型的病毒基因組上。插入的外源 DNA片段在大小同被取代的病毒基因組區(qū)段是等同的，這樣形成的重組體 DNA能夠在哺乳動物的受納細(xì)胞中增殖，并被包裝成病毒顆粒。
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