基因工程導(dǎo)論ppt課件(編輯修改稿)
2025-10-08 18:24 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 A 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA l 噬菌體的生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu) l 噬菌體是 大腸桿菌的溫和型噬菌體 l 噬菌體 由外殼包裝蛋白和 lDNA組成 lDNA全長 48502個核苷酸 lDNA上 至少有 61個基因 第十章 基因工程導(dǎo)論 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 l 噬菌體生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu) 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ COS COS cos 頭部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制 基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重組基因 刪除與整合基因 l DNA 第十章 基因工程導(dǎo)論 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA l 噬菌體生物學(xué)特性： 感染周期 體內(nèi)包裝 100個左右的拷貝 包裝范圍為原 DNA的 75 105% 即 36 51 kb D A 第十章 基因工程導(dǎo)論 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 縮短長度 野生型 lDNA包裝的上限為 51kb， 本身長度為 ， 只有當(dāng)插入的外源 DNA片段不大于 ， 才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒 。 因此縮短野生型 lDNA的長度 ， 可以提高裝載量 。 其實野生型 lDNA上約有 4050%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的 。 根據(jù)切除的多少 ， 可將 lDNA分成兩大類載體： 插入型載體 取代型載體 第十章 基因工程導(dǎo)論 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 縮短長度 插入型載體 體外包裝 插入位點 體外包裝 插入片段 載體長度 37 kb 插入片段大?。? 0 14 kb （ 51 – 37） 第十章 基因工程導(dǎo)論 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 縮短長度 取代型載體 體外包裝 體外包裝 插入片段 最小裝載長度 10 kb （ 51 – 26） 載體長度 26 kb 插入片段 最大裝載長度 25 kb （ 36 – 26） 第十章 基因工程導(dǎo)論 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA重組分子的體外包裝： lDNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒 ， 方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞 用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了 l噬菌體的大腸桿菌中提取 ， 現(xiàn)已商品化 。 這些包裝蛋白通常分為相互互補的兩部分：一部分缺少 E組份 ， 另一部分則缺少 D組份 。 包裝時 ， 當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組 lDNA分子混合后 ， 包裝才能有效進行 ， 任何一種蛋白包裝液被重組 lDNA污染后 ， 均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒 ， 這也是基于安全而設(shè)計的 第十章 基因工程導(dǎo)論 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 考斯質(zhì)粒 考斯質(zhì)粒（ cosmid） 考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建： 考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有 1978年 Collins和 Hohn發(fā)明構(gòu)建 pHC79 6400 bp Tcr l fragment cos ori Apr PstI BamHI SalI lDNA cos序列和 質(zhì)粒復(fù)制子的 特殊類型的載體 cos site carrying plasmid kb的 lDNA片段 + pBR322片段 裝載范圍為 31 45 kb 第十章 基因工程導(dǎo)論 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 考斯質(zhì)粒 考斯質(zhì)粒（ cosmid） 考斯質(zhì)粒載體的特點： 能像 lDNA那樣進行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量大（ 45 kb） 且克隆片段具有一定的大小范圍 能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞 中自主復(fù)制 重組操作簡便，篩選容易 不能體內(nèi)包裝，不裂解 受體細(xì)胞 第十章 基因工程導(dǎo)論 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 人造染色體載體 人類、動物、植物的全基因組序列分析往往 需要 克隆數(shù)百 甚至上千 kb 的 DNA片段， 此時考斯質(zhì)粒的裝載量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。 將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn) 定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外 源 DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體， 它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。 目前常用的人造染色體載體包括： 細(xì)菌人造染色體（ BAC） 酵母人造染色體（ YAC） 第十章 基因工程導(dǎo)論 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 人造染色體載體 酵母人造染色體（ Yeast Artificial Chromosomes YAC） YAC載體應(yīng)含有下列元件： 酵母染色體的端粒序列 酵母人造染色體的構(gòu)建： pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母染色體的復(fù)制子 酵母染色體的中心粒序列 酵母系統(tǒng)的 選擇標(biāo)記 大腸桿菌的復(fù)制子 大腸桿菌的 選擇標(biāo)記 YAC載體的裝載量為 350 400 kb 第十章 基因工程導(dǎo)論 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 人造染色體載體 酵母人造染色體（ Yeast Artificial Chromosomes YAC） 酵母人造染色體的使用： pYAC4 CEN EcoRI URA TEL BamHI TEL ori Apr TRP ARS EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 連接 轉(zhuǎn)化酵母菌 重組酵母染色體 第十章 基因工程導(dǎo)論 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第十章 基因工程導(dǎo)論 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 C 用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞 3 基因工程的基本條件 各種基因工程受體的特性 實驗室常用的基因工程受體 受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件 第十章 基因工程導(dǎo)論 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件 限制性缺陷型 外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（ recB， recC， hsdR） 重組整合缺陷型 用于基因擴增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞 （ recA） 具有較高的轉(zhuǎn)化效率 具有與載體選擇標(biāo)記互補的表型 感染寄生缺陷型 防止重組細(xì)菌
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