基因工程實驗流程ppt課件(編輯修改稿)
2024-10-08 18:24 本頁面
【文章內容簡介】 切酶、過濾柱 電泳儀器、凝膠成像系統(tǒng) 瓊脂糖 恒溫水浴鍋 超凈工作臺、烘箱、 PCR儀 培養(yǎng)基 超低溫冰箱 DMSO ? 利用特異探針，通過核酸雜交的方法或利用特異的抗體，通過抗原 抗體反應進行文庫目標基因的篩選 ? 將培養(yǎng)于平板的噬菌斑通過印跡轉于尼龍膜，并于核酸交聯(lián)儀中固定。在雜交箱中利用特定探針雜交。最后在恒溫搖床中洗膜（探針標記：放射性和非放射性） ? 將噬菌體培養(yǎng)于平板，于 42℃ 培養(yǎng)幾小時后，于 37℃ 用 IPTG誘導融合蛋白的表達并印記于尼龍膜上，利用抗原 抗體反應進行雜交 ? 利用 GSP（基因特異引物）通過 PCR擴增出目標基因 ? 利用 GSP，以文庫為模板通過 PCR擴增出目標基因，并通過電泳、凝膠成像系統(tǒng)檢測。利用文庫載體序列和已知的目標基因的序列設計通用引物和 GSP，通過 5’RACE和 3’RACE擴增出目標基因的 5’和 3’端序列。并通過電泳、凝膠成像系統(tǒng)檢測。 ? 通過 5‘RACE和 3’RACE克隆已知部分序列的目標基因 四、 DNA、 RNA的提取、純化和分析 ? 包含有目標基因的質粒的獲得 對于通過篩庫技術獲得的目標基因，通過噬菌體載體的自切割作用生成目標質粒。 ? 水稻基因組 DNA的提取、純化和分析 ? 水稻各器官 Total RNA的提取、純化和分析 質粒提取、分析 ? 常規(guī)質粒提取方法：通過細菌的適當裂解釋放出質粒，利用酚和氯仿抽提掉蛋白，再利用無水乙醇沉淀質粒 DNA ? 質粒提取試劑盒：裂解方法一致。裂解完成后利用過濾柱純化出質粒 DNA ? 質粒提取后，根據以后實驗要求利用不同的限制性內切酶在水浴鍋中進行酶切 ? 電泳，用凝膠成像系統(tǒng)分析 ? 測序 水稻基因組 DNA的提取、純化和分析 ? 利用 SDS法或 Qiagen提供的基因組提取試劑盒提取水稻基因組 DNA：利用 SDS在高鉀離子濃度的情況下能沉淀蛋白和多糖等雜質的原理提取基因組 DNA ? 利用酚 氯仿抽提或過濾柱純化基因組 DNA ? 水稻基因組文庫的構建 ? 利用特異的探針，通過 Southern blotting檢測目標基因的拷貝數 水稻各器官 Total RNA的提取、純化和分析 ? 分離所需的水稻各器官組織，并利用 Qiagen的 RNeasy系列試劑盒提取總 RNA：將材料裂解后，通過過濾柱純化出總RNA ? 在 RNasefree的情況下，通過甲醛變性膠電泳檢測總 RNA的質量 ? 利用特異性的探針，通過 Northern blotting檢測目標基因在各器官的表達情況 Southern blotting 基因組 DNA完全消化 探針制備 瓊脂水平電泳 比活性測定 印跡轉膜 DNA交聯(lián) 限制性內切酶、恒溫水浴鍋 手提紫外燈、電泳儀器 真空轉膜儀 紫外交聯(lián)儀 同位素檢測儀 探針制備試劑盒 尼龍膜 制備好的尼龍膜 探針（放射性或非放射性） 雜交 雜交箱 放射自顯影 熒光 同位素檢測儀 磷屏成像系統(tǒng) 熒光掃描 成像系統(tǒng) 克隆化基因的表達及表達蛋白的純化和功能分析 ? 克隆化基因的表達 ? 表達蛋白的純化 ? 功能分析 克隆化基因的表達 ? 基因的克?。豪酶弑Ｕ娴?Taq酶和合適的反應系統(tǒng)，通過 PCR獲得與目標基因完全一致的 DNA片段（通過測序確證） ? 體內表達：選擇合適的表達載體插入目標片段。利用化學方法或電轉化儀等手段轉入細胞表達 ? 體外轉錄和翻譯系統(tǒng)：兔網織紅細胞裂解物、小麥胚芽提取物等 表達蛋白的純化 ? SDS聚丙烯酰胺膠回收：利用 SDS聚丙烯酰胺膠分離不同大小的的蛋白。 ? 利用 6 HIS、 GST（谷胱甘肽）等和親和樹脂純化：通過表達目標基因的融合蛋白，利用親和層析洗脫出目標蛋白 ? 自動核酸 /蛋白純化工作站 目標蛋白功能分析 ? 抗體的制備：多抗、單抗 ? DNA蛋白質相互作用研究： Gelshift實驗、蛋白質磷酸化分析、酵母單雜交系統(tǒng)等 ? 蛋白質 蛋白質相互作用研究：酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體表面展示技術等 蛋白體內表達研究 ? Western blotting：利用抗原 抗體反應，對蛋白質混合物中的目標蛋白進行鑒別和定量 ? 免疫組織化學研究：通過切片技術和免疫反應，利用特異抗體檢測特定蛋白在組織細胞內的表達和定位 ? 蛋白質芯片系統(tǒng) 基因轉化實驗和轉基因結果分析 ? 轉基因載體的構建：載體、農桿菌、特殊抗生素 ? 植株的轉化：葉盤轉化法、基因槍 ? 植株的篩選：熒光檢測、 GUS染色、 PCR法 ? 基因功能分析：激光共聚焦顯微鏡、 FISH等 連接反應 ⑴ 在滅菌的 。 ⑵ 10μL體積反應體系中： 2 快速連接緩沖液 5μL 目的基因的雙酶切產物 XμL pMalc2x質粒雙酶切產物 XμL T4DNA連接酶 ⑶ 輕輕混勻，室溫下放置過夜。 注意事項： 目的基因和 c2x質粒雙酶切產物的加入比例應根據電泳結果而定，使加入的 2片段的濃度比為 1： 1 剩下的酶切片段不要丟掉，留做轉化時做對照 感受態(tài)菌的制備 （ 1） TB1
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