基因工程實(shí)驗(yàn)流程ppt課件(參考版)
2024-09-22 18:24本頁面
【正文】 該方法可以快速、高效地?cái)U(kuò)增 cDNA 或基因組 中已知序列兩側(cè)位置的片段。 反式 PCR 反式 PCR 克隆 cDNA 全長(zhǎng)的基因原理是：雙鏈 cDNA 合成后進(jìn)行尾 — 尾連接，環(huán)化的 cDNA 用位于已知序列內(nèi)的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)造成缺口或用 NaOH 處理使之變性，然后用 2條基因特異性引物對(duì)重新線性化或變性的 cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增。該方法適合于表達(dá)豐度高的基因的篩選分離。該方法能避免 PCR 擴(kuò)增的非特異性擴(kuò)增或錯(cuò)配，是一種比較準(zhǔn)確可靠的 cDNA 克隆方法。 從全長(zhǎng) cDNA 文庫中進(jìn)行雜交篩選 標(biāo)記探針 cDNA 文庫篩選法 cDNA 文庫通常涂抹到母盤培養(yǎng)基上，然后再把這些菌落的樣品吸印到硝酸纖維素膜或尼龍膜上；這時(shí)加入標(biāo)記的探針，如果出現(xiàn)雜交信號(hào)，那么從母盤上就可以把包含雜交信號(hào)的菌落分離、培養(yǎng)出來。同一轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，又是存在著不同的拼接方式，通過篩庫的辦法同時(shí)將不同拼接方式的 克隆 篩選出來可能性較小，而使用 PCR 擴(kuò)增后，有利于觀察到不同的拼接方式。而用 PCR 法從 cDNA 文庫中快速克隆基因的方法，只需提取 λ 噬菌體 DNA，按保守序列設(shè)計(jì) PCR 引物便可將未知片段進(jìn)行克隆。為了得到 cDNA 全長(zhǎng)，常常要重新篩選文庫。末端序列。早在 1988年， FROHMAN 等即用此方法成功地獲得了 4種 mRNA 的 539。RACE 均可 )。所用的 cDNA 模板可以使用多聚 dT 引物延伸合成 (339。 RACE )互補(bǔ)的通用引物，由于同聚體并非良好的 PCR 引物，同時(shí)為了便于 RACE 產(chǎn)物的 克隆 ，可向同聚體引物的 539。 RACE )或加至第一鏈 cDNA 339。 RACE )。 RACE )和 339。 ? 從非全長(zhǎng) cDNA 文庫中篩選新基因 RACE 法 RACE 文庫即快速擴(kuò)增 cDNA 末端法 ( Rapid Amplification of cDNA End， RACE )只需知道 mRNA 內(nèi)很短的一段序列即可擴(kuò)增出其 cDNA 的 539。分離方法主要有兩種：第一，對(duì)于非全長(zhǎng) cDNA 文庫，即不管是經(jīng)典的 cDNA 文庫方法或差減法構(gòu)建的 cDNA 文庫，需要利用已經(jīng)獲得的新 cDNA 序列片段，通過 RACE 方法獲得新基因的全長(zhǎng)序列。 EcoR V ← Tcloning site cDNA 文庫應(yīng)用分離新基因的方法 ? 發(fā)現(xiàn)并分離 克隆 新基因始終是分子生物學(xué)研究的主要任務(wù)和目的，雖然 cDNA 文庫的用途很多，但是，應(yīng)用于分離新基因是其最重要的用途。 因大部分耐熱性 DNA聚合酶進(jìn)行 PCR反應(yīng)時(shí)都有在 PCR產(chǎn)物的 339。這種載體由 pUC18載體改建而成 ， 在 pUC18載體 （ 參見第 12章基因工程的載體 ） 的多克隆位點(diǎn)處的 XbaI和 SalI識(shí)別位點(diǎn)之間插入了EcoR V識(shí)別位點(diǎn) ， 用 EcoR V進(jìn)行酶切反應(yīng)后 ， 再在兩側(cè)的 339。 成像分析 在 1% 的瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣電泳 ~1h， 電泳結(jié)束后 EB 染色 15～20min， 凝膠成像分析結(jié)果 。迅速冷卻 4℃ 。 3． PCR 反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置 94℃ 變性反應(yīng) 1min； 55℃ 退火反應(yīng) 45s； 72℃ 延伸反應(yīng) 1min。 PCR篩選 調(diào)整模板（ pMalade重組質(zhì)粒）濃度至 5 ng/ μL。：（ 1）如果要提高質(zhì)粒的濃度，可以用30?l Elution Buffer， 37℃ 或 50℃ 下放置 2分鐘， 10,000rpm室溫離心 1分鐘。不能劇烈混合，否則會(huì)出現(xiàn)基因組 DNA污染。 注意：對(duì)于低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，請(qǐng)用 2～ 5ml細(xì)胞，同時(shí)按比例相應(yīng)提高 Solution I，II和 III的用量。 將UNIQ10柱放入新的潔凈 ， 加 50?l Elution Buffer， 室溫放置 2分鐘后 ，10,000rpm室溫離心 1分鐘 。 重復(fù)步驟 7。 將步驟 5中上清轉(zhuǎn)移到套放于 UNIQ10柱中 ， 8,000rpm室溫離心 15秒 。 加入 350?l Solution III， 立即上下顛倒 5～ 10次 ， 使之充分中和 ， 室溫放置 2分鐘 。 加入 100?l Solution I，用槍頭或振蕩器充分懸浮細(xì)菌 。 （ 4）將 200μL上述培養(yǎng)物加到含 100μg/mL氨卞青霉素的 LB平板上（平板表面涂有 20mg/mL的 Xgal 40μL和 20mg/mL的 IPTG 40μL），以玻璃涂布棒輕輕地將轉(zhuǎn)化細(xì)胞平鋪于瓊脂平板表面。 （ 2）將該 EP管放入預(yù)加溫至 42℃ 的水浴中，放置 90s，快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻 1~2 min。 注意事項(xiàng)： 細(xì)胞一旦離開培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)操作要輕柔。 （ 3） 在預(yù)冷 4℃ 的離心機(jī)上以 4000 r/min離心 10min， 棄去上清 ， 加入 5mL預(yù)冷的 ， 冰浴上放置 10 min。 注意事項(xiàng)： 目的基因和 c2x質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物的加入比例應(yīng)根據(jù)電泳結(jié)果而定，使加入的 2片段的濃度比為 1： 1 剩下的酶切片段不要丟掉，留做轉(zhuǎn)化時(shí)做對(duì)照 感受態(tài)菌的制備 （ 1） TB1菌株 37℃ 過夜培養(yǎng)以復(fù)蘇菌種 ， 取過夜培養(yǎng)的菌液 1mL加入到50 mL LB培養(yǎng)基中 ， 37℃ ， 230 r
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