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2024-09-20 18:24本頁面
【正文】 ning) 的專用載體 。這種載體由 pUC18載體改建而成 ， 在 pUC18載體 （ 參見第 12章基因工程的載體 ） 的多克隆位點處的 XbaI和 SalI識別位點之間插入了EcoR V識別位點 ， 用 EcoR V進行酶切反應(yīng)后 ， 再在兩側(cè)的 339。端添加T 而成 。 因大部分耐熱性 DNA聚合酶進行 PCR反應(yīng)時都有在 PCR產(chǎn)物的 339。末端添加一個 A 的特性 ， 所以使用這種制品可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接 、 克隆效率 。 EcoR V ← Tcloning site cDNA 文庫應(yīng)用分離新基因的方法 ? 發(fā)現(xiàn)并分離 克隆 新基因始終是分子生物學(xué)研究的主要任務(wù)和目的，雖然 cDNA 文庫的用途很多，但是，應(yīng)用于分離新基因是其最重要的用途。前述的不管是哪種類型的 cDNA 文庫，都可以用于分離新基因，只是使用的方法有差異。分離方法主要有兩種：第一，對于非全長 cDNA 文庫，即不管是經(jīng)典的 cDNA 文庫方法或差減法構(gòu)建的 cDNA 文庫，需要利用已經(jīng)獲得的新 cDNA 序列片段，通過 RACE 方法獲得新基因的全長序列。第二，利用全長 cDNA 文庫與目的基因片段作為探針的雜交篩選。 ? 從非全長 cDNA 文庫中篩選新基因 RACE 法 RACE 文庫即快速擴增 cDNA 末端法 ( Rapid Amplification of cDNA End， RACE )只需知道 mRNA 內(nèi)很短的一段序列即可擴增出其 cDNA 的 539。(539。 RACE )和 339。端 (339。 RACE )。該法的主要特是利用一條根據(jù)已知序列設(shè)計的特異性引物和一條與 mRNA 的 PolyA (339。 RACE )或加至第一鏈 cDNA 339。端的同聚尾(539。 RACE )互補的通用引物，由于同聚體并非良好的 PCR 引物，同時為了便于 RACE 產(chǎn)物的 克隆 ，可向同聚體引物的 539。端內(nèi)加入一內(nèi)切酶位點。所用的 cDNA 模板可以使用多聚 dT 引物延伸合成 (339。， 539。RACE 均可 )。當(dāng) RACE PCR 產(chǎn)物為復(fù)雜的混合物時，可取部分產(chǎn)物作模板，用另一條位于原引物內(nèi)側(cè)的序列作為引物與通用引物配對進行另一輪 PCR (巢式 PCR )。早在 1988年， FROHMAN 等即用此方法成功地獲得了 4種 mRNA 的 539。合 339。末端序列。 ? 用 PCR 法從 cDNA 文庫中快速 克隆 基因 通過對文庫的篩選或適用簡并引物進行 PCR 反應(yīng)，常常只能獲得不完整的 cDNA 片段。為了得到 cDNA 全長，常常要重新篩選文庫。重新篩選文庫工作量大， RACE 雖然為此提供可方便，但應(yīng)用該方法需重新提取 mRNA 和反轉(zhuǎn)錄。而用 PCR 法從 cDNA 文庫中快速克隆基因的方法，只需提取 λ 噬菌體 DNA，按保守序列設(shè)計 PCR 引物便可將未知片段進行克隆。特別是在基因的兩端變異較大而中間某區(qū)域保守的情況下，用 PCR 法很容易獲取 cDNA 的全長。同一轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，又是存在著不同的拼接方式，通過篩庫的辦法同時將不同拼接方式的 克隆 篩選出來可能性較小，而使用 PCR 擴增后，有利于觀察到不同的拼接方式。另外，為研究基因在不同組織中表達情況，常根據(jù)差異顯示法找出特異的 mRNA。 從全長 cDNA 文庫中進行雜交篩選 標(biāo)記探針 cDNA 文庫篩選法 cDNA 文庫通常涂抹到母盤培養(yǎng)基上，然后再把這些菌落的樣品吸印到硝酸纖維素膜或尼龍膜上；這時加入標(biāo)記的探針，如果出現(xiàn)雜交信號，那么從母盤上就可以把包含雜交信號的菌落分離、培養(yǎng)出來。以此篩選出陽性克隆，進行序列分析，以獲得 cDNA 全長。該方法能避免 PCR 擴增的非特異性擴增或錯配，是一種比較準(zhǔn)確可靠的 cDNA 克隆方法。主要缺點是 克隆過程需要一系列的酶促反應(yīng)、產(chǎn)率低、費時長、工作量大。該方法適合于表達豐度高的基因的篩選分離。用于做標(biāo)記探針的 DNA 片段可以是其它生物的基因片段，在這種情況下篩選出來的基因往往是已分離基因的同源基因；如果用于做標(biāo)記探針的 DNA 片段是通過新分離蛋白質(zhì)的氨基酸反推設(shè)計的 DNA 序列，或者是特異分子標(biāo)記子 DNA 序列，那么可以篩選得到新功能基因。 反式 PCR 反式 PCR 克隆 cDNA 全長的基因原理是：雙鏈 cDNA 合成后進行尾 — 尾連接，環(huán)化的 cDNA 用位于已知序列內(nèi)的限制性內(nèi)切酶酶切位點造成缺口或用 NaOH 處理使之變性，然后用 2條基因特異性引物對重新線性化或變性的 cDNA 進行擴增。反式 PCR 的優(yōu)勢在于，它采用了 2條基因特異性引物，因此不易產(chǎn)生非特異性擴增。該方法可以快速、高效地擴增 cDNA 或基因組 中已知序列兩側(cè)位置的片段。 采集 5個自愿者的 DNA樣品 構(gòu)建 3種不同插入子大小的基因組文庫 2Kb, 10Kb和 50Kb 完成約 2700萬次插入子末端測序 ,總長 14800Mb GeneBank下載104018個 BAC末端順序 PFP發(fā)表的公開數(shù)據(jù)主要為 BAC克隆的順序 ,共 隨機測序與序列組裝方法和 指導(dǎo)測序與序列組裝方法 相結(jié)合進行序列組裝
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