【正文】 (miniviral replicon)， 插入在大腸桿菌的質(zhì)粒載體上 ，構(gòu)成了一種新型的病毒 — 質(zhì)粒載體 ， 稱為 微型病毒復(fù)制子 — 質(zhì)粒載體 。 (2)微型病毒復(fù)制子 質(zhì)粒載體 pTBC1就是一種典型的 SV40微型病毒復(fù)制子 質(zhì)粒載體，如果將這種載體導(dǎo)入 COS或 HFS細(xì)胞，它們就能利用細(xì)胞提供的 T抗原復(fù)制出非常大量的拷貝數(shù)?？梢杂脕砀咚降乇磉_(dá)外源蛋白質(zhì)。 （二）反轉(zhuǎn)錄病毒載體 反轉(zhuǎn)錄病毒 (retroviruses)是一類含單鏈 RNA的動物病毒。它的基因組含有 2條相同的正鏈 RNA分子，包裝成二倍體病毒顆粒。除此之外，在其病毒顆粒內(nèi)部還包含有 tRNA引物分子、反轉(zhuǎn)錄酶、 RNaseH和整合酶等組分。 迄今已經(jīng)在鳥類及哺乳類動物中發(fā)現(xiàn)了許多種反轉(zhuǎn)錄病毒。例如鳥類的脾壞死病毒 (SNV)、鼠類的乳腺腫瘤病毒 (MMTV)，莫洛尼氏小鼠白血病病毒 (Moloney murine leukemia virus，MoMLV)等等。 其中研究得最為詳盡的則要數(shù)勞斯肉瘤病毒(Rous sara virus， RSV)。 RSV病毒感染了雞之后，就會誘發(fā)產(chǎn)生腫瘤。從感染細(xì)胞中分離出來的反轉(zhuǎn)錄病毒的 DNA，是一種有用的動物細(xì)胞的基因載體。 反轉(zhuǎn)錄病毒家族可以分成三種不同的類群： ※ 泡沫病毒 (foamy viruses)類群 ， 例如人泡沫病毒 (HFV)； ※ 慢病毒 (Lentiviruses)類群 ， 例如人免疫缺損病毒 (HIV)I型和 Ⅱ 型 ， 以及綿羊髓鞘脫落病毒 (Visna virus)等； ※ 致癌病毒 (onco viruses)類群。并非所有本類群的病毒都是致癌的。根據(jù)在電子顯微鏡下觀察的病毒顆粒的形態(tài)學(xué)特征的差異，致癌病毒類群又可區(qū)分成 A、 B、 C、 D四個類型。 反轉(zhuǎn)錄病毒作為動物基因克隆載體的優(yōu)點： 第一 ， 在大多數(shù)情況下 ， 反轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤基因(oncogene， onc)都能夠在正常的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄 。 第二，反轉(zhuǎn)錄病毒的寄主范圍相當(dāng)廣泛，包括無脊椎動物和脊椎動物。其中有的還能夠在人體細(xì)胞中生長。 當(dāng)兩種不同的反轉(zhuǎn)錄病毒在同一寄主細(xì)胞中生長時，就會出現(xiàn)一種 DNA被另一種外殼蛋白質(zhì)包裝成假型病毒的奇特現(xiàn)象。由于病毒的寄主范圍實質(zhì)上是由其蛋白質(zhì)外殼決定的，因此使用這種假型病毒便有可能將某些病毒基因組導(dǎo)入正常無法感染的細(xì)胞，從而進(jìn)一步擴大寄主范圍。 第三 ， 反轉(zhuǎn)錄病毒具有強啟動子 ， 克隆于此類載體上的外源基因有可能得到有效的表達(dá) 。 有些反轉(zhuǎn)錄病毒 ， 例如鼠乳腺腫瘤病毒 ， 其啟動子的活性功能的開啟或關(guān)閉可以通過實驗手段予以控制 。 第四 ， 反轉(zhuǎn)錄病毒不但感染效率高 ， 而且通常還不會招致寄主細(xì)胞的死亡 ， 被它感染的或轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞能夠持續(xù)許多世代 ， 保持正常生長和形成感染性病毒顆粒的能力 。 因此 ， 有可能利用反轉(zhuǎn)錄病毒作載體 ， 改變動物細(xì)胞的基因型 ， 并可遺傳到子代細(xì)胞 。 (三 ） 其它的病毒載體 痘苗病毒 (Vaccinia virus)具有雙鏈 DNA基因組 ，同天花的病原體天花病毒 (Variola virus)的親緣關(guān)系十分密切 。 當(dāng)人們接種了痘苗病毒之后 ， 便可獲得對天花的高度免疫性 。 在 DNA重組技術(shù)發(fā)展之后不久 ， 就有人將外源 DNA片段插入到痘苗病毒的基因組中 ， 得到了具有生物活性的重組病毒 。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn) ， 基因工程學(xué)家便設(shè)想構(gòu)建能夠表達(dá)多種病原體抗原的重組痘苗病毒 ， 作為預(yù)防這些病原體感染的活疫苗 。 痘苗病毒載體 乳頭瘤病毒 (Papilloma viruses)能夠感染包括人類在內(nèi)的多種脊椎動物 ， 產(chǎn)生上皮腫瘤 ， 例如肉疣和乳頭瘤 。 已有研究表明 ， 人乳頭瘤病毒(Human papilloma virus， HPV)能夠誘發(fā)人宮頸癌 (human cervical carcinoma)。 可見 ， 此類病毒與人類的關(guān)系十分密切 。 但是只有完全分化的扁平的上皮細(xì)胞 (epithelial cell)， 才能產(chǎn)生感染性的乳頭瘤病毒 ， 迄今為止還沒有辦法在培養(yǎng)的細(xì)胞中增殖這種病毒 。 2． 乳頭瘤病毒載體 目前對于乳頭瘤病毒的分子生物學(xué)研究 ， 遠(yuǎn)遠(yuǎn)地落后于其它病毒 。 然而 有幾種乳頭瘤病毒的 DNA能夠轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的細(xì)胞 ， 而且在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi) ， 病毒的基因組保持游離的多拷貝的狀態(tài) ， 每個分離后的細(xì)胞可達(dá) 50一 200份 。 利用乳頭瘤病毒基因組這種非整合的特性 ， 克隆在它上面的外源基因的復(fù)制與表達(dá) ， 則可免受染色體的控制 ， 而得到大量的擴增 ， 同時又不會導(dǎo)致寄主細(xì)胞的裂解死亡 。 從這點考慮 ， 乳頭瘤病毒載體比上面所討論的整合性載體具有突出的優(yōu)點 ， 因而在近年很受人們的關(guān)注 。 ※ 腺病毒 (Adenoviruses)是一群無囊膜的 20面體的病毒 ， 所含的雙鏈 DNA的分子大小約為 36kb。 3． 腺病毒載體 ※ 腺病毒具有很大的發(fā)展為真核基因的表達(dá)體系潛力 。 這首先是因為它的基因組 DNA分子量大 ，可插入較大的外源 DNA片段 ， 而且還可以在寄主細(xì)胞中大量地增殖 。 其次 ， 在腺病毒感染周期中 ，寄主蛋白質(zhì)合成被關(guān)閉掉了 ， 因此能最大限度地合成病毒編碼的蛋白質(zhì) ， 這種特性為克隆基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物的檢測與純化提供了很大的方便 。 ※ 構(gòu)建腺病毒載體的重要步驟是 ， 設(shè)法減少其基因組 DNA中某些核酸內(nèi)切限制酶的切割位點的數(shù)目 。 腺病毒載體的構(gòu)建 ※ 在腺病毒載體的構(gòu)建過程中，失去某種限制位點的腺病毒 DNA是在體外選擇的。例如，失去 XbaI限制位點的 Ad5 DNA的變異體，是先用 XbaI切割腺病毒 DNA，然后把消化片段重新連接起來之后獲得的。根據(jù)此類再生片段的感染性，便可篩選出由這些片段重新連接形成的完整的基因組。于是就構(gòu)建出減少了某種核酸內(nèi)切限制酶切割位點的腺病毒載體。 ※ 由于在腺病毒的兩段反向末端重復(fù)序列中 ，只要有一段是完整的 ， 另一段的缺失也就能夠得到恢復(fù) 。 因此 ， 可以利用靠近 5’末端的 El早期基因區(qū)克隆外源基因 。 例如已經(jīng)證明 ， Ad2左邊末端片段在體外克隆和突變之后 ， 再連接到缺失了左邊末端片段的 Ad5基因組 DNA上 ， 這樣的重組體分子感染了人細(xì)胞之后 ， 會正確地再生出左邊末端片段 ， 從而恢復(fù)了腺病毒 DNA的末端重復(fù)結(jié)構(gòu) ， 而且子代病毒 DNA也是具有感染性的 。 ※ 應(yīng)用上述辦法 ， 已在 El早期基因區(qū)引入了若干突變 ， 但假若不提供輔助功能 ， 如此形成的重組的腺病毒是不能夠在人 HeLa細(xì)胞中生長的 。 同樣的道理 ， 如果通過這種辦法將外源基因插入在El早期基因區(qū) ， 也就必須提供輔助功能才能完成感染周期 。 現(xiàn)在通常是用能表達(dá) El功能的人細(xì)胞系 (293細(xì)胞 )提供這種輔助功能的 。 因為腺病毒并不能夠感染猿猴細(xì)胞 ， 而含有SV40病毒 T抗原的重組分子卻可以在這種細(xì)胞中表達(dá) 。 ※ 因此 ， 構(gòu)建腺病毒 SV40重組載體可以擴大腺病毒的感染范圍 ， 能夠在其它非受體細(xì)胞 (如猿猴細(xì)胞 )中有效地生長 。 在體外已經(jīng)構(gòu)建成的這類腺病毒 SV40重組載體中 ， T抗原基因的表達(dá)是在腺病毒主要的晚期啟動子控制下進(jìn)行的 。這種類型的腺病毒載體有可能得到進(jìn)一步的發(fā)展 。