基因工程制藥ppt課件-資料下載頁
2025-01-05 09:16本頁面
【正文】 從 cDNA文庫中分離特異 cDNA克隆。 免疫反應(yīng)鑒定法：無基因表型特征，無合適探針時(shí)使用。 分離到含有目的基因的陽性克隆后，必須對(duì)其作進(jìn)一步的驗(yàn)證和鑒定。主要是限制酶圖譜的繪制、雜交分析、基因定位、基因測(cè)序、確定基因的轉(zhuǎn)錄方向、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)等。 二、化學(xué)合成法 較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以用化學(xué)合成法合成。 必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序。 ?原理： DNA是由 3’， 5’磷酸二酯鍵連接 ?技術(shù)： DNA自動(dòng)合成儀 用化學(xué)法合成目的基因 DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的 DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進(jìn)行退火使連接成較長(zhǎng)的 DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。 人工化學(xué)合成基因的限制有： ⒈不能合成太長(zhǎng)的基因。目前 DNA 合成儀所合成的寡核苷酸片段僅為 50～ 60 bp，因此只適用于克隆小分子肽的基因。 ⒉ 遺傳密碼的簡(jiǎn)并使選擇密碼子困難，用氨基酸順序推測(cè)核苷酸序列，得到的結(jié)果可能與天然基因不完全一致，易造成中性突變。 ⒊費(fèi)用高。 利用該法合成的基因有人生長(zhǎng)激素釋放抑制因子、胰島素原、腦啡肽及干擾素基因等。 工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建中重要的工具酶 ?大腸桿菌 DNA聚合酶 I： 5’— 3’DNA聚合酶活性。 ?逆轉(zhuǎn)錄酶： 轉(zhuǎn)錄 RNA為 DNA的酶。 ?核酸酶 S1：能降解單鏈 DNA和 RNA ，打開 cDNA雙鏈的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。 ? T4DNA連接酶：連接 3’ 羥基 5’磷酸游離端。 ?末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶：催化一個(gè)單核苷酸轉(zhuǎn)移到一個(gè) DNA分子的 3’羥基末端。
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