【正文】 或 EcoBI[B株 ]) ? 識別特定位點(diǎn) (EcoKI識別 5‘...AAC(N)6GTGC序列， EcoBI識別5’...TGA(N)8TGCT序列 )并隨機(jī)切斷 DNA。 (2)hsdM (Host specificitive defective Methylation) ? DNA甲基化酶 ? 識別特定位點(diǎn)并甲基化 (3)hsdS ? 輔助 hsdR和 hsdMD ? 停止密碼子相關(guān)的基因型 supE(Suppressor E)表達(dá)的阻遏蛋白與停止密碼子 UAG結(jié)合，使蛋白質(zhì)合成停止。 supE基因變異時，不能表達(dá)正常的阻遏蛋白，遇到停止密碼子 UAG,蛋白質(zhì)合成仍能繼續(xù)，并使UAG作為一個密碼子編碼谷氨酰胺（ Glutamine）。 supF表達(dá)的阻遏蛋白與停止密碼子 UAG結(jié)合，使蛋白質(zhì)合成停止。 supF基因變異時，不能表達(dá)正常的阻遏蛋白，遇到停止密碼子 UAG,蛋白質(zhì)合成仍能繼續(xù)，并使 UAG作為一個密碼子編碼酪氨酸 （ Tyrosine）。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 4） ? 點(diǎn)突變相關(guān)的基因型 mutS(Mutator)表達(dá)的蛋白具有識別 DNA上錯配序列的功能，并能修復(fù)其錯配序列（ GC→AT），防止基因突變。 mutT特異性地降解 dGTP成為單磷酸鹽狀態(tài)的 dGMP， DNA合成受到阻礙，防止 dGTP插入模板 DNA中導(dǎo)致 AT轉(zhuǎn)換成 GC,使 DNA產(chǎn)生變異。 dut(dUTPase)表達(dá)脫氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶 (dUTPase)，它能水解 dUTP成為 dUMP,使細(xì)胞體內(nèi) dUTP的濃度維持在較低的水平，防治 dUTP造成的 A→U的基因突變。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 5） ? 抗藥性相關(guān)的基因型 gyrA(Gyrase)表達(dá) DNA促旋酶 A亞基。 DNA促旋酶在 DNA復(fù)制時具有使 DNA解旋和回旋的作用。 rpsL(Ribosomal protein small subunit)表達(dá)核糖體 30S亞基中的 S12蛋白質(zhì)， S12蛋白作用于翻譯的開始階段。鏈霉素 (Streptomycin)作用位點(diǎn)就是核糖體 30S亞基上的 S12蛋白質(zhì)，正常情況下鏈霉素與 S12蛋白結(jié)合使蛋白質(zhì)的生物合成不能進(jìn)行，細(xì)胞停止生長。 rpsL基因的變異使鏈霉素失去結(jié)合位點(diǎn)，從而使該基因型的菌株具有了對鏈霉素的抗性 (Strr)。 Tn5(Transposon)是帶有卡那霉素 (Kanamycine)抗性基因的轉(zhuǎn)座子，當(dāng) Tn5轉(zhuǎn)位到大腸桿菌基因組時，能使此菌株獲得卡那霉素的抗性 (Kan r)。 Tn10(Transposon)是帶有四環(huán)素 (tetracycline)抗性基因的轉(zhuǎn)座子。當(dāng) Tn10轉(zhuǎn)位至大腸桿菌基因組時，能使此菌株獲得四環(huán)素的抗性 (Tet r)。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 6） ? 能量代謝相關(guān)的基因型 lacZ(Lactose)是大腸桿菌中 lac操縱子的結(jié)構(gòu)基因，表達(dá) β半乳糖苷酶，分解乳糖為半乳糖苷。 lacZ 基因的變異或缺失將直接導(dǎo)致 β半乳糖苷酶活性缺失。 lacZ M15是表達(dá) β半乳糖苷酶 α片斷的一段基因，當(dāng)△ M15時， β半乳糖苷酶沒有活性。 lac操縱子上的結(jié)構(gòu)基因有 lacZ(β半乳糖苷酶 )、 lacY(透性酶 )、 lacA(乙酰基轉(zhuǎn)移梅 )得以正常表達(dá)。 ara(Arabinose)表達(dá)阿拉伯糖代謝所需的各種酶，其中 araA表達(dá)阿拉伯糖異構(gòu)酶、 araB表達(dá)核酮糖激酶、 araC表達(dá)阻遏蛋白， araD表達(dá) L核酮糖 4磷酸差向異構(gòu)酶、 araE表達(dá)低親和型 L阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、 araF表達(dá) L阿拉伯糖結(jié)合蛋白、 araG表達(dá)高親和性的 L阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。 gal(Galactose)表達(dá)半乳糖代謝所需的各種酶類及調(diào)節(jié)蛋白，其中 galE表達(dá)尿苷二磷酸 (UDG)半乳糖 4差向異構(gòu)酶、 galK表達(dá)半乳糖激酶、 galP表達(dá)半乳糖透性酶、 galR表達(dá)半乳糖操縱子的阻遏蛋白、 galT表達(dá)半乳糖 1磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、 galU表達(dá)葡萄糖 1磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 7） ? 氨基酸代謝相關(guān)的基因型 thy A(Thymine）表達(dá)胸苷酸合成酶，參與胸腺嘧啶的代謝。 thyA基因的變異可以利用胸腺嘧啶進(jìn)行菌株篩選。 proA(Proline)表達(dá) γ谷氨酸磷酸還原酶，作用于脯氨酸生物合成的第二步。 proA基因的變異或缺失，使脯氨酸的生物合成受阻，在用最小培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞時需要特別添加脯氨酸。 proB(Proline)表達(dá)谷氨酸巖 5磷酸激酶，它能催化三磷酸鹽與谷氨酸鹽結(jié)合形成谷氨酸 5磷酸鹽，是脯氨酸合成的第一步。 proB基因的變異或缺失，使脯氨酸合成受阻，在用最小培養(yǎng)基培養(yǎng)時需特別添加脯氨酸。 thr(Thronine)包含 thrA、 thrB和 thrC三種基因。 thrA表達(dá)天冬氨酸激酶及 I高絲氨酸脫氫酶，thrB表達(dá)高絲氨酸激酶， thrC表述蘇氨酸合成酶。 thr 基因的變異使細(xì)胞不能合成蘇氨酸，用最小培養(yǎng)基培養(yǎng)時需添加蘇氨酸。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 8） ? 維生素代謝相關(guān)的基因型 bioH(Biotin)表達(dá)的蛋白能催化前生物素到生物素的轉(zhuǎn)化，還能對庚二酰 CoA有優(yōu)先的阻害作用。 bioH基因的變異使細(xì)胞不能自身合成生物素，在最小培養(yǎng)基中必須添加生物素，細(xì)胞才能正常生長。 thi(Thiamin)表達(dá)硫胺素，包含有 thiA 、 thiB 、 thiC 、 thiD 、 thiK 、 thiL 等。 thiA表達(dá)硫氨素噻唑轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、 thiB表達(dá)硫氨素磷酸鹽焦磷酸化酶、 thiC表達(dá)硫氨素嘧啶轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、thiD表達(dá)磷酸甲基化嘧啶激酶、 thiK表達(dá)硫氨素激酶、 thiL表達(dá)硫氨素甲磷酸激酶。 thi的變異使硫氨素的生物合成不能進(jìn)行，最小培養(yǎng)基中必須添加硫氨素（ VB1），細(xì)胞才能正常生長。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 9） ? 蛋白酶相關(guān)的基因型 lon(long form)表達(dá) ATP依賴型蛋白分解酶 (La)，它對外源的異型蛋白質(zhì)具有特異性的分解作用。 lon基因的變異或缺失，使細(xì)胞中的這種異型蛋白質(zhì)分解酶不能得到表達(dá)，這對于保持克隆體目的蛋白的穩(wěn)定是非常有利的。 ompT(Outer membrane protein)表達(dá)特異性的外膜蛋白分解酶，它特異性地分解與細(xì)胞膜結(jié)合的含鐵腸菌素受體蛋白。 ompT基因的變異使膜結(jié)合性蛋白分解酶活性缺失，有利于融合蛋白的表達(dá)。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 10） ? 1物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合相關(guān)的基因型 tonA(Transport)和 fhuA(Ferric hydroxamateuptake)基因處于基因組圖同一位點(diǎn)，它們的作用也相同，都是表達(dá)外膜受體蛋白。這種受體蛋白與鐵絡(luò)合物結(jié)合，并與 tonB 蛋白相互協(xié)調(diào)作用，把鐵化合物運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。 tonA和 fhuA基因的變異使細(xì)胞對鐵離子的吸收受到阻害，同時使細(xì)胞對某些抗菌素及噬菌體更敏感，有利于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和菌體篩選。 tsx(Tsix)基因表達(dá) T6噬菌體和大腸桿菌素 K的受體蛋白，它結(jié)合于細(xì)胞膜的外表面，對 T6噬菌體和大腸桿菌素 K進(jìn)入細(xì)胞起關(guān)鍵作用。另外 tsx受體蛋白還有與核苷酸特異性結(jié)合的功能，是核苷酸特異性運(yùn)輸通道的第一步，在核苷酸的吸收方面也起重要作用。 tsx 基因的變異使外界某些噬菌體及大腸桿菌素等對細(xì)胞的侵噬變得困難，有利于細(xì)胞基因組的穩(wěn)定。 cysA(Cysteine)基因表達(dá)硫酸鹽 /硫代硫酸鹽轉(zhuǎn)移蛋白，參與細(xì)胞對硫酸鹽的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，通過 cysA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的硫酸鹽將參與半胱氨酸的生物合成。 cysA基因的變異使半胱氨酸的生物合成受到影響，在培養(yǎng)此基因型的菌株時要注意添加半胱氨酸。 ? 1其他 deoR(Deoxyribose)是大腸桿菌中 deo操縱子的調(diào)節(jié)基因，它表達(dá)的阻遏蛋白對 deo操縱子具有重要的調(diào)控作用。 deo操縱子含有 deoA、 deoB、 deoC和 deoD等結(jié)構(gòu)基因，分別表達(dá)DNA代謝所需的酶類，即胸腺嘧啶磷酸化酶、磷酸轉(zhuǎn)位酶、脫氧核糖磷酸醛縮酶和嘌呤核苷磷酸化酶。 deoR基因的變異，使 deo操縱子的阻遏蛋白不能表達(dá)，宿主細(xì)胞合成大量的 dCTP，可以選擇性地改善大分子 DNA的轉(zhuǎn)化。 relA(Relaxed)是松弛調(diào)節(jié)基因，對 RNA的合成具有調(diào)節(jié)抑制作用。同時 relA基因還表達(dá)ATP:GTP3`焦磷酸轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)在氨基酸饑餓狀態(tài)下鳥苷 3` ,5`二磷酸 (ppGpp)的合成，以適應(yīng)饑餓環(huán)境。 tyrT(Tyrosine)基因?qū)ｉT負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄酪氨酸 tRNA(轉(zhuǎn)運(yùn) RNA)， tyrT基因的變異使以酪氨酸為主的蛋白質(zhì)的合成受阻。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 12） ? DH5α? ： F–， φ80， lacZΔM15， Δ(lacZYAargF)U169， recA1， endA1，hsdR17 (rK–, mK+) ， phoA， supE44 ， gyrA96 ， relA1 課堂小練習(xí) F：缺失 F質(zhì)粒 . Φ80：宿主攜帶 λ噬菌體 φ 80. lacZ ΔM15：刪除編碼 β半乳糖苷酶的部分 lacZ基因 (α片斷的一段基因 ). Δ(lacZYAargF)U169： lacZYA表示 lacZ(β半乳糖苷酶 )、 lacY(透性酶 )、 lacA(乙?；D(zhuǎn)移梅 )， argF基因是精氨酸合成酶， U169表示三個 lac基因和 argF基因之間缺失了 10000bp. hsdR17 (rK–, mK+) ： R17代表特異性識別蛋白發(fā)生變異， (rK–, mK+) 表示由于 R17的變異而導(dǎo)致 K12株來源的 hsdR 功能缺失 . phoA： 大腸桿菌堿性磷酸酶 . gyrA96 ：突變 DNA解旋酶 常用于基因工程的宿主菌 ，菌株不同，基因型亦不同，不同載體要求不同菌株。 如： DH5: F–, endA1, hsdR17(rk–,mk+ ),supE44,thi–,λ–,recA1, relA1,gyrA96 DH5α: F–, endA1, hsdR17(rk–,mk+ ),supE44,thi–,λ–, recA1, relA1,gyrA96。 φ80dlacZ△ M15, △ (lacZYAargF)U169 E .coli DH5αF’: F’, endA1, hsdR17(rk–,mk+ ),supE44,thi–, λ–, recA1, relA1, gyrA96,φ80dlacZ△ M15, △ (lacZYAargF)U169 i. 三者均有重組基因缺陷，外源 DNA可存活，且不發(fā)生重組。 ii. DH5α和 DH5αF’都具有一個可供遺傳標(biāo)記 lacZα檢測的遺傳背景。 iii. DH5αF’可供 M13mp系列載體配套使用， M13病毒的感染需要 F’的存在。 ? 啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因 539。端上游的 DNA序列，能活化 RNA聚合酶，使之與模板 DNA準(zhǔn)確的結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。 ? 啟動子本身并不控制基因活動，而是通過與稱為轉(zhuǎn)錄（ transcription）因子的這種蛋白質(zhì)（ proteins）結(jié)合而控制基因活動的。 ? TATA框的主要作用是使轉(zhuǎn)錄精確地起始； CAAT框和 GC框則主要是控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率，特別是 CAAT框?qū)D(zhuǎn)錄起始頻率的作用更大。 ? Kozak序列和 SD序列對于 mRNA的翻譯起重要作用。 啟動子 啟動子可分為 誘導(dǎo)型啟動子 和 組成型啟動子 兩大類，后者包括 CMV， SV40， T7, pMC1，PGK啟動子等。 組成型啟動子 (constitutive promoter)是指在該類啟動子控制下，結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)大體恒定在一定水平上，在不同組織、部位表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。 誘導(dǎo)型啟動子 (inducible promoter)是指在某些特定的物理或化學(xué)信號的刺激下，該種類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平。 CMV啟動子： 巨細(xì)胞病毒的啟動子。 CMV啟動子（增強(qiáng)子）被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建高效真核表達(dá)載體。 CMV是大家公認(rèn)的啟動真核基因表達(dá)的最有力量的啟動子。 ? 終止子 (terminator T)是給予 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的 DNA序列。在一個操縱元中至少在構(gòu)基因群最后一個基因的后面有一個終止子。 ? 終止子位于 poly(A)位點(diǎn)下游，長度在數(shù)百堿基以內(nèi)的結(jié)構(gòu)。 終止子 終止子可分為兩類：一類不依賴于蛋白質(zhì)輔因子就能實(shí)現(xiàn)終止作用。另一類則依賴蛋白輔因子才能實(shí)現(xiàn)終止作用。這種蛋白質(zhì)輔因子稱為釋放因子，通常又稱 ρ因子。 兩類終止子有共同的序列特征。在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)前有一段回文序列。