【文章內(nèi)容簡介】 T4DNA連接酶的作用下 — 將不同聯(lián)接器聯(lián)接到目的基因的兩端 —— 經(jīng)兩種不同的限制酶切割后，再與載體重組。 ? 平接法：具有 3’羥基和 5’磷酸?；钠侥┒?DNA片斷之間，在 T4DNA連接酶的作用下，形成共價結(jié)合的過程。 ? 優(yōu)缺點(diǎn)：是 DNA重組中最簡單的一種方法，任何齊平末端外源 DNA片段及載體之間均可以進(jìn)行重組。在基因工程中用途較大，對于沒有交錯切割位點(diǎn)的外源 DNA片段的重組，具有特別重要的意義。但反應(yīng)速度慢，僅為粘接法的 1%， ? T4DNA連接酶用量大，為粘接法的 1030倍。 ? 作業(yè)題：在重組實(shí)驗(yàn)中，如何防止或消除自身再環(huán)化作用和線性聚合體？ ? 影響連接效果的因素有哪些？ （三）、重組 DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞 ? 問題：體外構(gòu)建的重組 DNA為什么要導(dǎo)入宿主細(xì)胞？P28 ? 重組體 DNA的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染： ? 問題：什么是轉(zhuǎn)化？什么是轉(zhuǎn)染？兩者有何異同？什么是轉(zhuǎn)化率？什么是轉(zhuǎn)化頻率？ ? 轉(zhuǎn)化（ transformation）：是一種外源 DNA分子或片斷進(jìn)入受體細(xì)胞使后者獲得新的遺傳性狀的過程。 ? 轉(zhuǎn)染（ transfection）：裸露的病毒 DNA或 RNA感染寄主細(xì)胞的過程。 ? 兩者之間的關(guān)系：兩者的不同是 DNA的來源不同。而過程相同的， 也就是說本質(zhì)上兩者之沒有根本的差別， ? 所以習(xí)慣上人們往往也把轉(zhuǎn)染通稱為廣義的轉(zhuǎn)化。 ? 轉(zhuǎn)化率：指轉(zhuǎn)化細(xì)胞占受體細(xì)胞的比例。 ? 轉(zhuǎn)化頻率：指在受體細(xì)胞過量的情況下，重組 DNA所能獲得的轉(zhuǎn)化子的菌落數(shù)。 ? 影響轉(zhuǎn)化率的因素：第一，宿主限制 修飾系統(tǒng)的影響； ? 第二，宿主細(xì)胞人工感受態(tài)形成率對轉(zhuǎn)化率有重大的影響； ? 第三，重組 DNA的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化率也有關(guān)； ? 第四，外源基因與宿主染色體 DNA的同源性與轉(zhuǎn)化率也有關(guān)； ? 第五，轉(zhuǎn)化體系中重組 DNA的濃度與純度對轉(zhuǎn)化率有一定的影響。 ? 重組體 DNA的體外包裝及入噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)： ? 問題：什么是轉(zhuǎn)導(dǎo)？什么是體外包裝？體外包裝的基本原理和方法怎樣？ ? 轉(zhuǎn)導(dǎo)：以病毒為介導(dǎo)（載體）將遺傳物質(zhì)從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞的過程。 ? 在基因 工程中，是指借助溫和噬菌體或病毒的感染作用將重組的 DNA轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞的過程。 ? 限制 性轉(zhuǎn)導(dǎo)：由溫和噬菌體和病毒 DNA為載體構(gòu)成的重組 DNA分子，經(jīng)體外包裝成完整的噬菌體或病毒顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。 ? 廣義轉(zhuǎn)導(dǎo)：任意 DNA片斷或重組 DNA 分子經(jīng)體外包裝完整的噬菌體顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)。 ? 所謂體外包裝：就是在體外將重組的 DNA放置到噬菌體的外殼里，然后通過正常的噬菌體感染過程，將它們導(dǎo)入宿主細(xì)胞。 ? 體外包裝采用噬菌體感染過的大腸桿菌溶解液，也就是包裝提取物（ packaging extract）進(jìn)行的。 ? 包裝提取物（ packaging extract）包括： ? E蛋白：是噬菌體頭部的主要成分。 ? D蛋白：位于噬菌體頭部外側(cè)并與噬菌體頭部成熟有關(guān)。 ? A蛋白：與入噬菌體 DNA插入頭部，與粘性末端形成有關(guān)。 ? Z蛋白：是尾部的主要成分。 ? 得到包裝提取物的方法 ： ? 一種是雖然可以從入噬菌體直接提取到包裝蛋白，但是這種方法比較復(fù)雜，不能成為常規(guī)技術(shù)。 ? 另一種方法 是采用 E基因變異株和 A基因變異株（ E和A）或（ E和 D）的入噬菌體感染大腸桿菌。 ? 以入噬菌體作基因載體進(jìn)行基因克隆有以下優(yōu)點(diǎn)： ? 具有很大的外源 DNA包容能力，對外源基因的克隆效率高； ? 有非常高的入重組回收率，特別是適用于建立基因庫； ? 具有正性篩選性質(zhì)。 （四）、重組體克隆的篩選與鑒定 ? 問題： 為什么要對重組體進(jìn)行篩選和鑒定？ ? 篩選的方法如何？原理如何？ ? 方法：遺傳檢測法、核酸雜交法、免疫化學(xué)法、物理檢測法和 DNA順序法等。 ? 依據(jù)是根據(jù)載體體系、宿營主細(xì)胞的特征以及外源基因在受體細(xì)胞表達(dá)不同，即： ? 直接篩選方法：是針對載體攜帶的某種標(biāo)記基因和目的基因而設(shè)計(jì)的篩選方法。特點(diǎn)是直接測定基因和基因表型。 ? 間接篩選是不直接測定基因，而是利用其它方法，例如利用特異性抗體與目的基因表達(dá)產(chǎn)物相互作用對重組體的篩選。 ? 利用表型 特征篩選（遺傳檢測法）： ? 表型 是指機(jī)體遺傳組成同環(huán)境相互作用所產(chǎn)生的外觀或其它特征。 ? 這些特征一個是克隆載體提供的這是最主要的也是應(yīng)用最多的；另一個是插入的外源 DNA序列提供的，相對來說數(shù)量較少。 ? （ 1）、抗藥性標(biāo)記插入滅活篩選法： ? 原理： ? 特點(diǎn)：是一種簡便快速的方法 。但有時由于試劑或操作規(guī)程方面的原因，自身環(huán)化的載體分子有時也會失去特定的遺傳標(biāo)記。 ? （ 2）、 223。半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法： ? 原理： ? 優(yōu)點(diǎn)：是更為簡單的方法 。 ? 利用插入序列提供的表形特征篩選。 ? 這種篩選要求： ? （ 1）、克隆的 DMA片斷是一個完整的基因序列； ? （ 2）、而且能夠在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)。 ? 這無疑是一個很大局限，特別是對真核基因。 ? 利用核酸雜交技術(shù)篩選： ? 從基因文庫中篩選帶有目的基因插入序列的克隆，最廣泛應(yīng)用的是核酸分子雜交技術(shù)。它是根據(jù)核酸雜交原理，利用基因探針撿測出培養(yǎng)平板上重組轉(zhuǎn)化體菌落的位置。故也稱為原位雜交技術(shù)或菌落（噬菌斑）雜交。 ? 核酸雜交技術(shù)：用基因探針與樣品中的 DNA或mRNA進(jìn)行雜交以檢測其中是否含有目的基因或目的 mRNA存在的技術(shù)。 ? 原位雜交技術(shù)：讓含有重組體的菌落或是噬菌斑，由平板轉(zhuǎn)移到膜上并釋放 DNA ，變性并固定在膜上，再同 DNA探針雜交的方法。 ? 方法：培養(yǎng) —— 影印 —— 溶菌 —— 固定 —— 顯色 —— 對號取菌。 ? 優(yōu)點(diǎn)：可以廣泛的應(yīng)用。特別是適合于大量群體的篩選。 ? 利用免疫學(xué)方法篩選： ? 免疫學(xué)方法是間接篩選方法，也就是利用特異抗體與目的基因表達(dá)產(chǎn)物相互作用進(jìn)行篩選的方法。 ? 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)、靈敏度高、特別是適用于選擇不為宿主提供任何選擇標(biāo)記基因的篩選。 ? （ 1）、放射性抗體檢測方法： ? 原理：一種免疫血清含有 IgG抗體，它們識別抗原分子的不同決定簇，并分別與各自的抗原決定簇相結(jié)合?？贵w分子或抗體的 F（ ab）部分能夠牢固地吸附在固體基質(zhì)（例如聚已烯等塑料制品）上。而不會被洗脫掉， ? 通過體外碘化作用， IgG抗體便會被放射性同位素 125I 標(biāo)記上。 ? 方法：培養(yǎng) —— 影印 —— 裂菌 —— 覆蓋 —— 處理 ——獲取所需的重組克隆。 （ 2）、免疫沉淀檢測法 ? 這種方法相對于放射性免疫法來講，靈敏度要低，而且易受干擾。但是它的價值在于操作簡便易行。 ? 方法：在生長菌落的瓊脂培養(yǎng)基中，加入專門抗這種蛋白質(zhì)分子 的特異性抗體。如果有些菌落的細(xì)胞能分泌出目的蛋白，就會在它的周圍出現(xiàn)一條叫做沉淀素的抗原 抗體沉淀物所形成 的白色園圈。 ? 這種方法的缺點(diǎn)是只能檢測分泌出細(xì)胞的蛋白質(zhì)，這就限制了該法的應(yīng)用。要用來檢測非分泌的蛋白質(zhì)，需要對該法進(jìn)行改良。 轉(zhuǎn)譯篩選法 ? 概述：在基因工程中。通過基因重組，篩選的最終目的是獲得高表達(dá)的基因工程細(xì)胞，通過工程化生產(chǎn)有用的物質(zhì)。因此所獲得的重組體能否表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物是關(guān)鍵的問題。采用相應(yīng)的技術(shù)檢查工程細(xì)胞目的產(chǎn)物