【文章內容簡介】 短，大多在 110450bp之間。 ※ 扣除雜交是比較兩個群體的 mRNA 表達差異，從而克隆僅在其中一個群體中表達的基因的有力的方法。 原理： 首先，把兩個群體分離的 mRNA反轉錄成 cDNA；我們把含有特異基因表達的群體的 cDNA做 “ tester”，參照群體的 cDNAs為 driver； 然后在 driver過量的情況下將兩者進行雜交，除去雜交的序列；結果，那些未雜交的 cDNAs即是 tester中特異表達的 mRNA. 六、抑制性扣除雜交法 (未知序列基因克?。? （ suppression subtractive hybridization, SSH) ※ 特別實用于分離在特定組織中表達的基因，在細胞周期特定階段表達的基因，受生長因子調節(jié)的基因，以及在特定發(fā)育階段表達的或者是參與發(fā)育調節(jié)的基因。同時亦可有效分離經特殊處理而誘導表達的基因。 Diatchenko et al . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996,93: 60256030 工作流程： cDNA synthesis Tester and driver ds cDNA are prepared from the two mRNA samples under parison Rsa I digestion Tester and driver cDNA are separately digested to obtain shorter, bluntended molecules Adaptor ligation Two tester populations are created with different adaptors, but driver cDNA has no adaptors First hybridization Hybridization kiics lead to equalization and enrichment of differentially expressed sequences Second hybridization Templates for PCR amplification are generated from differentially expressed sequences First PCR amplification Using suppression PCR, only differentially expressed sequences are amplified exponentially Second PCR amplification Background is reduced and differentially expressed sequences are further enriched Plant Physiol. 138:20872096, 2022 SSH 實例 1：分離耐低磷基因 SSH 實例 2：分離螟蟲特異性表達基因 將扣除雜交技術和 cDNA點陣技術相結合，得到水稻被二化螟誘導表達的基因，推測水稻對二化螟防御反應分子機制，克隆并鑒定水稻被二化螟特異誘導表達的啟動子。 將水稻被二化螟取食后葉鞘 mRNA及對照 mRNA分別作為 tester和 driver構建 cDNA扣除文庫，文庫 I以二化螟取食后葉鞘 mRNA為 tester，以對照 mRNA為driver，文庫 Ⅱ 剛好相反。 Hua et al. Plant Mol. Biol. 2022, 65:519530 SSH 兩輪 PCR的結果 SSH 文庫的檢測 SSH cDNA 文庫的 macroarry檢測 候選克隆的 Northern驗證 通過 SSH的方法分離到螟蟲誘導性的啟動子 七、酵母雙元雜交系統(tǒng) Yeast Twohybrid System 酵母雙元雜交系統(tǒng)的應用 ? 驗證傳統(tǒng)方法檢測的相互作用的蛋白 ? 蛋白的功能作圖 – 功能域 /氨基酸 ? 鑒別新的相互作用蛋白 (from a cDNA library) 本項技術已被廣泛地應用于真核基因的表達和調控、細胞粘合因子間的相互作用、信號傳導路徑以及細胞周期與分化、反式因子的鑒定與分離等諸多領域。 ? Gal4 protein prises DNA binding domains(BD) and activating domains (AD) ? Binding domain interact with promoter ? Activating domain with transcription machinery 背景知識 Gal4雙元系統(tǒng)介紹 背景知識 ? Gal4 protein: the two domains of the protein do not need to be transcribed in a single protein ? Just as long as they are both recruited to the promotor Gal4 背景知識 Chimeric proteins Plasmids carrying different constructs can be expressed in yeast Binding domain as a translational fusion with the gene encoding another protein in the same plasmid Activating domain as a translational fusion with the gene encoding a third protein in a second plasmid Plasmid vectors 背景知識 背景知識 作用機制 Yeast twohybrid system 實例 Wu et al. Cell. 2022, 125: 13471360 作用機制 作用機制 作用機制 作用機制 八、 TDNA、轉座子標簽法 TDNA/Transposon tagging 利用同源或異源轉座子 (如玉米的 Ac/Ds系統(tǒng) )、TDNA隨機插入基因組中引起基因失活，產生出易識別的突變表型的特點，鑒定未知基因。然后，通過分離轉座子兩側的宿主基因組的 DNA序列，從文庫中分離目的基因。 原理： 篩選文庫 候選基因 基因互補分析 不同類型的轉座子有不同的轉座 熱點 和轉座 頻率 單個位點 Mutator的誘變頻率約 104－ 106 九、功能基因組研究與大規(guī)模 TDNA插入突變體庫的構建 （ 擴展內容 ） 1. 人類基因組計劃與全基因組測序Human Genome Pr