大腸桿菌基因工程(2)(編輯修改稿)
2025-06-22 06:23 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 碳源 ：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等 應避免外源基因表達的“葡萄糖效應”。 氮源 ： 有機氮：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿 無機氮： 氨水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等 其他： 無機鹽、微量元素維生素、生物素等 工程菌生長與表達主要影響因素 菌齡與接種量 菌齡： 自接種起培養(yǎng)的時間（小時） 影響停滯期、質(zhì)粒宏觀逃逸率 接種量： 是指接入的種子液體積占培養(yǎng)液體積的百分比 接種量過?。?延長菌體停滯期，質(zhì)粒宏觀逃逸率高 接種量過大： 菌體生長過快，代謝產(chǎn)物積累過多，抑制后 期菌體的生長，降低表達水平。 pH值、溫度與溶解氧 pH值： 影響生長速度、表達水平和產(chǎn)物可溶性。 生長最適 pH范圍在 ，表達最適 pH為 溫度： 影響生長速度、表達水平和產(chǎn)物可溶性。 生長最適 37℃ ，較低溫度利于可溶性表達。 溶解氧 ： 影響生長速度和表達水平 誘導時機與收菌時機 誘導時機： 過早影響生物量、過晚影響表達水平 一般在生長曲線對數(shù)中期或?qū)?shù)后期進行誘導 收菌時機： 過早影響表達水平、過晚影響產(chǎn)物穩(wěn)定 性、可溶性、并造成浪費。 一般在表達曲線平臺期（誘導后 34小時）收菌 ? 主要研究參數(shù)： 培養(yǎng)基、接種量、 pH值、溫度、誘導與收菌時機等 ? 主要觀察指標 表達水平（ %）、生物量、表達產(chǎn)物積累（包涵體形成）情況、質(zhì)粒宏觀逃逸率等 ? 結果： 生長曲線與表達曲線 工程菌搖瓶水平生長與表達試驗 ? 基本要求： 高表達、高生物量、便于放大、低成本 ? 重點問題： 1）質(zhì)粒穩(wěn)定性問題 2）表達與生長的矛盾問題 3）發(fā)酵方式問題： 分批式 or流加式發(fā)酵？常規(guī)發(fā)酵 or高密度發(fā)酵？ 工程菌發(fā)酵工藝基本要求與重點問題： 工程菌工業(yè)發(fā)酵工藝研究 工程菌工業(yè)發(fā)酵工藝流程 甘油種 活化 試管 /搖瓶 放大 /種子罐 發(fā)酵 /發(fā)酵罐 工程菌發(fā)酵工藝流程 菌種活化： 參數(shù)： 培養(yǎng)基、溫度、培養(yǎng)時間（菌齡） 指標： 菌體濃度（ OD600）、質(zhì)粒宏觀逃逸率 放大培養(yǎng)（種子液制備）： 參數(shù)： 菌齡、接種量、培養(yǎng)基、溫度、溶氧、攪 拌速度、轉(zhuǎn)接時機（菌齡）、放大級數(shù) 指標： 菌體濃度（ OD600）、質(zhì)粒宏觀逃逸率 結果： 生長曲線 工程菌發(fā)酵工藝研究主要內(nèi)容 發(fā)酵（放大培養(yǎng)與表達）： 參數(shù)： 種子液菌齡、接種量、培養(yǎng)基、溫度、溶氧、攪 拌速度、誘導時機、收菌時機 指標： 菌體濃度、表達水平、質(zhì)粒宏觀逃逸率 結果： 生長曲線、表達曲線 工程菌發(fā)酵工藝研究主要內(nèi)容 發(fā)酵方式： 1）批式發(fā)酵： 較常用，高表達、但菌體量較少。 2）流加發(fā)酵： 較常用，主要補充碳源，菌體量大、表達 水平下降，碳源流加時機和速度是關鍵。 *高密度發(fā)酵： 無機鹽介質(zhì)，通過碳源限制和流加實現(xiàn) 高密度發(fā)酵。 3）連續(xù)發(fā)酵：少用，高表達、高總生物量、難控制。 工程菌發(fā)酵工藝研究主要內(nèi)容 基因工程發(fā)酵 表達產(chǎn)物分離純化工藝研究 ? 分離純化工藝研究的目的、任務和要求 ? 分離純化工藝設計原則 ? 粗提工藝 ? 精純工藝 *精純主要任務 *分離純化總策略 *色譜技術為基礎的精純工藝 分離純化工藝研究的目的、任務和要求 ? 目的： 建立高效、便于規(guī)模放大和質(zhì)控的表達產(chǎn)物分離 純化工藝 ? 任務： 建立粗提工藝：從菌體或培養(yǎng)液中獲取目的產(chǎn)物，包涵體形式表達的尚包括變性和復性處理。 建立精純工藝：去除蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)，使純度達到指定要求。 建立工藝過程質(zhì)控體系 ? 要求： 高活性、高得率、高純度、低費用 表達產(chǎn)物分離純化原則 ? 要建立一個方便靈敏的蛋白檢測方法，以估價每一步的提純程度；
環(huán)評公示相關推薦
鄂ICP備17016276號-1