大腸桿菌基因工程(2)(已修改)
2025-06-07 06:23 本頁面
【正文】 基因工程 Geic Engineering 主講教師：李黃金 Email: 任課教師：張文峰、陳偉 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院 ２０ 13 第三章 大腸桿菌基因工程 Escherichia coli （ SEM， 14000） 四、工程菌構(gòu)建、分析、發(fā)酵與產(chǎn)物分離純化 三、工程菌構(gòu)建策略 二、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)原理 一、 大腸桿菌表達(dá)（生產(chǎn)）系統(tǒng)的優(yōu)缺點 五、利用大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白案例 第三章 大腸桿菌基因工程 ? 工程菌構(gòu)建 ? 發(fā)酵工藝研究 ? 分離純化工藝研究 四、工程菌構(gòu)建、發(fā)酵與產(chǎn)物分離純化 工程菌構(gòu)建研究內(nèi)容與技術(shù)路線 目的蛋白分析 表達(dá)載體與宿主菌株選擇 目的基因的獲得與優(yōu)化 表達(dá)載體構(gòu)建與分析 轉(zhuǎn)化與表達(dá)篩選 工程菌穩(wěn)定性分析 表達(dá)產(chǎn)物確證 工程菌菌種保存 目的蛋白分析： 糖基化？難表達(dá)？難復(fù)性？藥用？ 1)理化特性 () *分子大?。?≤5KD、 ≥100KD難表達(dá) （融合表達(dá)、截短表達(dá)） *氨基酸組成： Cys、 Pro多的難表達(dá) （用真核系統(tǒng)） *疏水性：疏水性強的難表達(dá) （截短表達(dá)、用真核系統(tǒng)） 2)生物學(xué)特性： 膜蛋白難表達(dá) （ 截短表達(dá)、用真核系統(tǒng)） 工程菌構(gòu)建主要研究內(nèi)容 3)用途 藥用：安全性、產(chǎn)量、成本 （包涵體、獨立表達(dá)） 工業(yè)用：產(chǎn)量、成本 （包涵體、獨立表達(dá)） 研究用：迅速獲得活性產(chǎn)品為首要考慮 （可溶、融合表達(dá)） 工程菌構(gòu)建主要研究內(nèi)容 選擇表達(dá)載體與宿主菌株： 1）表達(dá)載體選擇 啟動子、標(biāo)簽、標(biāo)記基因、拷貝數(shù)等。 需要可溶表達(dá)時采用弱啟動子， T7啟動子最強， PL/PR熱激誘導(dǎo)不宜工業(yè)化。 從蛋白特性、用途、發(fā)酵和分離純化工藝考慮標(biāo)簽。 藥用避免氨芐青霉素，用卡拉霉素。 4）宿主菌： 符合表達(dá)要求（ T7 RNA酶溶源？可溶？稀有密碼 tRNA？），來源與遺傳背景清楚，資料翔實。 工程菌構(gòu)建主要研究內(nèi)容 目的基因獲得、分析與優(yōu)化 克隆、合成、索要？ 工程菌構(gòu)建主要研究內(nèi)容 ? 翻譯起始位點與終止密碼子：頭尾不要缺，中間不能斷 ? GC含量：＞ 70%時表達(dá)水平低 ? 二級結(jié)構(gòu) ： mRNA 二級結(jié)構(gòu)抑制翻譯的起始或終止。 ? 基因或者蛋白的大?。阂话阏f來小于 5kD 或者大于 100kD 的蛋白都是難以表達(dá)的。前者融合表達(dá)，后者截取表達(dá)（如抗原用途，選抗原性強、好表達(dá)區(qū)段）。 ? 疏水性：疏水性強的、特別是膜蛋白難表達(dá)。截取表達(dá)。 ? N端和 C端穩(wěn)定性 ：人為突變末端殘基。 表達(dá)載體構(gòu)建與分析 1）根據(jù)選定載體物理圖和基因特點設(shè)計與構(gòu)建 PCR擴增目的基因： *引物中引入適當(dāng)?shù)拿盖形稽c，避免基因內(nèi)部位點。 *是否需要目的基因帶入 ATG和 TAA？是否要對框？ 2）表達(dá)載體酶切分析：雙酶切、多酶切圖譜分析 3）目的基因序列分析：目的基因或表達(dá)盒序列分析 工程菌構(gòu)建主要研究內(nèi)容 pET21a質(zhì)粒物理圖譜 pET21a質(zhì)粒多克隆位點與表達(dá)盒 pET32a質(zhì)粒物理圖譜 pET32a質(zhì)粒多克隆位點與表達(dá)盒 M 1 2 3 4 目的基因： VLΔω, 表達(dá)載體： pET32a M： Maker， 1kb lader 1： PCR產(chǎn)物，引物含 NcoI、 HindIII 2： HindIII單酶切 pET32a質(zhì)粒 3： NcoIHindIII雙酶切重組子 4： HindIII單酶切重組子 pET32aVLΔω酶切鑒定 轉(zhuǎn)化與表達(dá)篩選 1）轉(zhuǎn)化選定的工程菌宿主株（不同于克隆宿主菌?。? 2） 表達(dá)篩選： 以表達(dá)水平（ %）為指標(biāo)。 表達(dá)水平（ %） =目的產(chǎn)物占總蛋白的百 分?jǐn)?shù) 測定方法： SDSPAGE+凝膠掃描分析 工程菌構(gòu)建主要研究內(nèi)容 表達(dá)產(chǎn)物確證 1）基本要求： SDSPAGE + WesternBlot 2）特殊要求（如基因工程藥物）：
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