大腸桿菌耐藥株的體外誘導(dǎo)及其acra和mara基因分析(已修改)
2025-08-16 15:25 本頁(yè)面
【正文】 大腸桿菌耐藥株的體外誘導(dǎo)及其acrA和marA基因分析張海旺1 鄧旭明2* 張煜1 蘇杰1 胡仲明3（，河北 張家口，075131；，吉林 長(zhǎng)春；130062；，吉林 長(zhǎng)春；130062）摘要：目的 檢測(cè)大腸桿菌在某些抗菌素的環(huán)境壓力下耐藥性的變化及其與acrA和marA基因突變的關(guān)系。方法 分別用四環(huán)素、氯霉素和環(huán)丙沙星對(duì)大腸桿菌質(zhì)控株ATCC25922進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，測(cè)定誘導(dǎo)前后多種抗菌藥的MIC的變化；對(duì)各菌株的acrA和marA基因進(jìn)行克隆和測(cè)序。結(jié)果 四環(huán)素誘導(dǎo)株產(chǎn)生多重耐藥，氯霉素和環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)引起單藥耐藥；四環(huán)素誘導(dǎo)株、氯霉素誘導(dǎo)株和環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株的acrA和marA基因序列均與ATCC25922的一致。結(jié)論四環(huán)素、氯霉素和環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)培養(yǎng)并未引起ATCC25922的acrA和marA基因的突變，誘導(dǎo)引起的大腸桿菌耐藥性變化是由于其acrA和marA基因突變以外的其他原因所致。關(guān)鍵詞：大腸桿菌 多重耐藥 外輸泵 acrA marA由于抗菌藥物的廣泛、持續(xù)和不當(dāng)使用，各種病原菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性日趨嚴(yán)重。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞膜上的外輸泵（efflux pump）的表達(dá)水平提高，能主動(dòng)將擴(kuò)散入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的藥物或其他底物泵出菌體外，從而使細(xì)菌獲得非特異性的耐藥性。大腸桿菌是畜禽的重要致病菌，是發(fā)現(xiàn)外輸泵最多的細(xì)菌，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了約30種外輸泵。一般認(rèn)為AcrAB－TolC是大腸桿菌主要的外輸泵[1]。它包括藥物質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)子AcrB、周質(zhì)融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC[2]。MarA是一個(gè)正調(diào)控蛋白，可增強(qiáng)acrAB和tolC的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)用四環(huán)素、氯霉素和環(huán)丙沙星通過(guò)人工體外誘導(dǎo)大腸桿菌使之產(chǎn)生耐藥性，對(duì)AcrA和MarA的基因acrA和marA進(jìn)行測(cè)序分析，檢測(cè)耐藥性產(chǎn)生與acrA和marA突變的關(guān)系。1 材料和方法 材料菌株：大腸桿菌質(zhì)控株ATCC25922，購(gòu)自吉林省衛(wèi)生監(jiān)督檢測(cè)中心。抗菌藥：頭孢噻肟、青霉素鉀等，均為標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌?，中?guó)藥品生物制品檢定所出品；鹽酸環(huán)丙沙星，對(duì)照品，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所出品。染色試劑：結(jié)晶紫酒精飽和溶液、草酸銨溶液、革蘭氏碘溶液、石碳酸復(fù)紅溶液等按《藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)》[3]進(jìn)行配制。載體與質(zhì)粒：克隆載體為pGEM－T，Promega公司產(chǎn)品。酶與試劑：T4 DNA連接酶、Ex TaqTM DNA 聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、溶菌酶、蛋白酶K均為TaKaRa公司產(chǎn)品。其他試劑：乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2）、焦碳酸二乙酯（DEPC），Sigma公司產(chǎn)品；dNTP、5－溴－4－氯－3－吲哚半乳糖苷（X－gal）、異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（Amp）、瓊脂糖、羥基甲基氨基甲烷（Tris）等均為TaKaRa公司產(chǎn)品；飽和酚、氯仿、異丙醇、CaCl葡萄糖、甲基紅等，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭籇NA片段凝膠回收試劑盒（Agarose Gel DNA Purification Kit ），TaKaRa公司產(chǎn)品；國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目，No 30270999作者介紹：張海旺，生于1956年，博士，教授。研究方向：耐藥機(jī)理。*通訊作者 Email：zhw5148@..分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物：DNA Marker DL2,000、λ－Hind Ⅲ digest DNA Marker，均為TaKaRa公司產(chǎn)品。引物：根據(jù)GenBank中acrA、marA基因序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物：acrA的上游引物（PACR－F）序列為5180。－ATG AAC AAA AAC AGA GGG TTT ACG CCT－3180。；下游引物（PACR－R）5180。－TTA AGA CTT GGA CTG TTC AGG CTG－3180。，marA的上游引物（PMAR－F）序列為5180。－ATG ACG ATG TCC AGA CGC AAT AC－3180。，下游引物（PMAR－R）5180。－CTA GCT GTT GTA ATG ATT TAA TGG－3180。上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。儀器：生物顯微鏡，OLYMPUS產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀，TC－25/H型，杭州 DAHE THERMO－MAGNETICS ；電泳儀，DYY－6B型，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；空氣浴振蕩器，HZQ－C，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，TGL－16M，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)等。. 方法 菌株鑒定對(duì)購(gòu)進(jìn)的菌株作生化和形態(tài)鑒定，以確保菌株的可靠性：用營(yíng)養(yǎng)肉湯作復(fù)蘇培養(yǎng)，再將菌液接種于瓊脂平板37oC培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落；取上一步得到的單菌落進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖）、靛基質(zhì)試驗(yàn)、V—P試驗(yàn)鑒定及革蘭氏染色的光鏡觀察。鑒定確認(rèn)為ATCC25922的菌株作后續(xù)實(shí)驗(yàn)之用。 MIC測(cè)定按照NCCLS（National Committee for Clinical Laboratory Standards）規(guī)定的方法配制包括誘導(dǎo)劑（氯霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星）在內(nèi)的各種受試抗菌藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液；用2倍連續(xù)稀釋法配制各種含抗菌藥的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，～（據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)情況再作升或降的調(diào)整）。在1ml培養(yǎng)基中接種100μl菌液（約為105CFU）；37oC培養(yǎng)24h，確定MIC。 誘導(dǎo)分別在三種含1/2MIC誘導(dǎo)劑的
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