【正文】 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) 大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征 大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì) 全基因組測(cè)序，共有 4405個(gè)開(kāi)放型閱讀框架 基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善 繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定 被美國(guó) FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) 大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征 大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì) 缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能 缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng) 內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白 細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) 外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理 啟動(dòng)子 終止子 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 密碼子 質(zhì)粒拷貝數(shù) 轉(zhuǎn)錄 翻譯 P tac = 3 P trp = 11 P lac 啟動(dòng)子 35 區(qū)序列 10 區(qū)序列 P lac T T T A C A T A T A A T P trp T T G A C A T T A A C T P tac T T G A C A T A T A A T P traA T A G A C A T A A T G T P lL T T G A C A G A T A C T P recA T T G A T A T A T A A T 啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理 具有多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu) ， 基因排列次序?yàn)椋? 啟動(dòng)子 （ lacP） 操縱基因 （ lacO） 結(jié)構(gòu)基因 （ lacZlacYlacA） 正調(diào)節(jié)因子 CAP 負(fù)調(diào)節(jié)因子 lac I 啟動(dòng)子 Lac 表達(dá)系統(tǒng) 以大腸桿菌 lac 操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì) 、 構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) lacI Plac lacO lacZ lacY lacA 高效轉(zhuǎn)錄 cAMP CAP lacI Plac lacO lacZ lacY lacA RNA 聚合酶 基底水平轉(zhuǎn)錄 Lac 表達(dá)系統(tǒng) 正調(diào)節(jié)因子 CAP cAMP激活 CAP， CAP–cAMP復(fù)合物與 lac 操縱子上專一位點(diǎn)結(jié)合 后，能促進(jìn) RNA 聚合酶與 –3 –10 序列的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn) Plac 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。 RNA 聚合酶 RNA 聚合酶 基因工程中使用的 lac 啟動(dòng)子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即 Plac UV5 cAMP 葡萄糖代謝 cAMP濃度降低 cAMP CAP CAP Lac 表達(dá)系統(tǒng) lac UV5 突變體 Plac UV5 突變體能夠在沒(méi)有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 轉(zhuǎn)錄 ， 受它控制的基因 在轉(zhuǎn)錄水平上只受 lacI 的調(diào)控 ， 因此用它 構(gòu)建的表達(dá)載體在使用時(shí)比野生型 Plac 更易操作 。 Lac 表達(dá)系統(tǒng) 負(fù)調(diào)節(jié)因子 lac I 在無(wú)誘導(dǎo)物情形下 ， lacI 基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白 ， 與啟動(dòng) 子下游的操縱基因緊密結(jié)合 ， 阻止轉(zhuǎn)錄的起始 。 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA RNA 聚合酶 基底水平轉(zhuǎn)錄 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA 高效轉(zhuǎn)錄 RNA 聚合酶 IPTG mRNA Tac 表達(dá)系統(tǒng) tac 啟動(dòng)子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的雜 合啟動(dòng)子 。 調(diào)控模式與 lacUV5 相似 ， 但 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平更高 于 trp 和 lacUV5 啟動(dòng)子 （ P tac = 3 P trp = 11 P lac） ， 因此在要求有較高基因表達(dá) 水平的情況下 ， 選用 tac 啟動(dòng)子比用 lacUV5 啟動(dòng)子更優(yōu)越 。 啟動(dòng)子 35 區(qū)序列 10 區(qū)序列 P lac T T T A C A T A T A A T P trp T T G A C A T T A A C T P tac T T G A C A T A T A A T lac、 tac 啟動(dòng)子對(duì)宿主菌的要求 在普通大腸桿菌中 ， LacI 阻遏蛋白僅能滿足細(xì)胞染色體上 lac 操縱子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的需要 。 當(dāng)多拷貝的 lacO 隨著帶有 lacUV tac 啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入 大腸桿菌后 ， LacI 阻遏蛋白與 lacO 的比例顯著下降 ， 無(wú)法保證每一 個(gè) lacO 都能獲得足夠的 LacI 阻遏蛋白參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控 。 表現(xiàn)為在無(wú)誘 導(dǎo)物存在的情形下 ， lacUV tac 啟動(dòng)子有較高的本底轉(zhuǎn)錄 。 lac、 tac 啟動(dòng)子對(duì)宿主菌的要求 為了使以 Lac、 Tac 表達(dá)系統(tǒng)具有嚴(yán)緊調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄的能力 ， 一 種 能產(chǎn)生過(guò)量的 LacI 阻遏蛋白 的 lacI 基因的突變體 lacIq 被應(yīng)用于表 達(dá)系統(tǒng) 。 大腸桿菌 JM109 等菌株的基因型均為 lacIq ， 常被選用為 Lac、 Tac 表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌 。 但是這些菌株也只能對(duì)低拷貝的表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)嚴(yán)緊調(diào)控 ， 在使用高拷 貝復(fù)制子構(gòu)建表達(dá)載體時(shí) ， 仍能觀察到較高水平的本底轉(zhuǎn)錄 。 需在表達(dá)載體中插入 lacIq 基因以保證有較多的 LacI 阻遏蛋白產(chǎn)生 。 lac、 tac 表達(dá)系統(tǒng)存在的問(wèn)題 IPTG 用于誘導(dǎo) lac、 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄 ， 但由于 IPTG 本身具有一定的 毒性 。 從安全角度 ， 對(duì)表達(dá)和制備用于 醫(yī)療目的的重組蛋白 并不適合 。 一些國(guó)家規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝中不能使用 IPTG 解決方法 lac 和 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)緊調(diào)控 乳糖替代 IPTG 誘導(dǎo) lac 和 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄 lac、 tac 表達(dá)系統(tǒng)存在的問(wèn)題 lac 和 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)緊調(diào)控 把阻遏蛋白 LacI 的溫度敏感突變體 lacI(ts)、 lacIq(ts)插入表達(dá)載體或 整合到染色體后 ， 均能使 lac 和 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受到溫度嚴(yán)緊調(diào)控 在較低溫度 （ 30℃ ） 時(shí)抑制 ， 在較高溫度 （ 42℃ ） 時(shí)開(kāi)放 。 用乳糖替代 IPTG 誘導(dǎo) lac 和 tac 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄 乳糖在 b半乳糖苷酶作用下生成異乳糖 ， 異乳糖具有誘導(dǎo)劑的作用 這一過(guò)程涉及乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化 ， 其效率受到多種因素的影響和制約 因此乳糖誘導(dǎo)的有效劑量大大高于 IPTG。 乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用 ， 較多的乳糖存在也 會(huì)導(dǎo)致菌體生理及生長(zhǎng)特性變化 。 乳糖替代 lPTG 作為誘導(dǎo)劑的研究 要與發(fā)酵工藝結(jié)合起來(lái) ， 才能顯示其良好的前景 。 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理 色氨酸啟動(dòng)子 Ptrp 受色氨酸 阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底 狀態(tài)。 在培養(yǎng)系統(tǒng)中 去除色氨酸 或者 加入 3吲哚丙烯酸 （ IAA）， 便可有 效地解除阻遏抑制作用。 在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中 往往添加 IAA 誘導(dǎo) Ptrp 介導(dǎo)的目的基因表達(dá) 啟動(dòng)子 Trp 表達(dá)系統(tǒng) 以大腸桿菌 trp 操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì) 、 構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) Trp 表達(dá)系統(tǒng) Ptrp Otrp RNA 聚合酶 基底水平轉(zhuǎn)錄 高效轉(zhuǎn)錄 mRNA Ptrp Otrp 去除 色氨酸 高效轉(zhuǎn)錄 mRNA Ptrp Otrp 加入 IAA RNA 聚合酶 RNA 聚合酶 PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng) 以 l 噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子 PL 、 PR 為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) 在野生型 l 噬菌體中 ， PL 、 PR 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄與否決定了 l 噬菌體進(jìn)入 裂解循環(huán)還是溶源循環(huán) 。 啟動(dòng)子 PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 由 l 噬菌體 PE 啟動(dòng)子控制的 cI 基因的產(chǎn)物是 PL 、 PR 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的 阻遏物 。 cI 基因的產(chǎn)物在大腸桿菌宿主中的濃