【文章內(nèi)容簡介】 識別位點的專一性 , 一般在識別序列內(nèi)切割 Ⅲ 型：作用方式同 Ⅱ 型 命名方式 Ⅱ 型限制性核酸內(nèi)切酶 1. 基本特性 ① 識別 dsDNA中含４ 8個相連的堿基對組成的特定回文序列 ② 斷裂后形成的 DNA片段具有互補堿基的單鏈延伸末端（粘性末端）或平末端 5’ － C T G C A G － 3’ 3’ － G A C G T C － 5’ 5’ － G G A T C C － 3’ 3’ － C C T A G G － 5’ 5’ － G A T C － 3’ 3’ － C T A G － 5’ 5’ － G G 3’ － C C C C － 3’ G G － 5’ 5’ － G G C C － 3’ 3’ － C C G G － 5’ HaeⅢ MboⅠ BamHⅠ PstⅠ 5’ － 3’ － C T A G － 5’ 5’ － G A T C － 3’ － 5’ 5’ － G 3’ － C C T A G － 5’ 5’ － G A T C C － 3’ G － 5’ 5’ － C T G C A － 3’ 3’ － G G － 3’ 3’ － A C G T C － 5’ II型限制性內(nèi)切核酸酶 幾種 II型限制性核酸內(nèi)切酶的 酶切位點 2. 同裂酶 (isoschizomer)— 來源不同 , 識別和切割位點相同 3. 同尾酶 (isoaudamers)— 來源、識別序列和切割方式均不相同，但產(chǎn)生的限制性片段卻是相同的粘性末端 4. 限制性內(nèi)切酶對 DNA的消化作用及其片段化 ① 消化作用 — 以同型二聚體形式與靶 DNA序列作用，所識別的靶序列大小決定著 DNA片段的大小 ② 片段化 :單酶切、雙酶切、一部分酶切 5. 具有粘性末端 DNA片段的連接 ① 不同的 DNA片段通過互補的粘性末端配對連接 — 分子間連接 ② 同一片段的兩個互補末端之間堿基配對形成環(huán)形分子內(nèi)連接 載體與目的片段連接 6. 影響限制性內(nèi)切酶活性的因素 ① DNA的純度 ② DNA甲基化程度 ③ 底物 DNA的分子構(gòu)型 ④ 反應(yīng)溫度 ⑤ 反應(yīng)系統(tǒng)組成 ⑥ 酶量、反應(yīng)體積、酶切時間 7. 限制酶的用途 ① DNA重組與構(gòu)建新基因組文庫 ② 組建 DNA物理圖譜 ③ DNA 分子雜交 ④ 制備 DNA放射性探針 ⑤ DNA序列分析 DNA連接酶 封閉 DNA鏈上缺口酶，借助能量催化 DNA鏈的 5′PO4與另一 DNA鏈的 3′OH生成磷酸二酯鍵。 用于DNA重組和質(zhì)粒的構(gòu)建 1. 大腸桿菌 DNA連接酶： 只能連接具粘性末端 DNA分子，以 NAD作輔助因子 2. T4 DNA連接酶 ：連接粘性末端，高濃度可連接平末端，要求 3′OH和 5′PO4 。催化過程需要 ATP和 Mg 聚合酶 以 DNA(RNA)為模板，催化 DNA(RNA)的體外合成 特點： ① 以脫氧核苷酸三磷酸 (dNTP)為前體催化合成 DNA ② 需要模板和引物的存在 ③ 不能起始合成新的 DNA鏈 ④ 催化 dNTP加到生長中的 DNA鏈的 339。OH末端 ⑤ 催化 DNA合成的方向是 539?！?39。 聚合酶的分類及特點 1. 大腸桿菌 DNA聚合酶 Ⅰ ： ① 5′→3 ′的聚合作用 ② 3 ′→5 ′的外切酶活性 ③ 5′→3 ′外切酶活性 2. Klenow 聚合酶： ① 5′→3 ′聚合酶活性 ② 3 ′→5 ′外切酶活性 ③ 沒有 5′→3 ′外切酶活性 ④ 用于填補 DNA單鏈末端成為雙鏈 聚合酶的分類及特點 3. T4DNA聚合酶 ：無 5′→3 ′外切酶活性 、需要一條有引物的單鏈 DNA作模板 、 3 ′ →5 ′外切酶活性 4. Taq DNA 聚合酶 ： ① 5′→3 ′聚合酶活性 ② 5′→3 ′外切酶活性，有鏈置換合成能力 ③ 不具有 3 ′ →5 ′外切酶活性，沒有校正功能 ④ 良好的熱穩(wěn)定性 ⑤ 用于 DNA序列分析和 PCR反應(yīng) 逆轉(zhuǎn)錄酶（ reversetranscriptase） 兩類：禽類成骨細胞性白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶 (AMV) moloney小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶 (MMLV) 作用： 1. 以 RNA為模板合成 DNA,構(gòu)建 cDNA文庫 2. RTPCR 3. 制備雜交探針 以 RNA為模板合成 DNA的酶 ( RNA指導(dǎo)的 DNA聚合酶 ) 1. 堿性磷酸酶（ alkaline phosphatase）： 去除 DNA /RNA 5′P，制備載體時可防止載體自身連接， 提高重組效率 2. 末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶： 在 DNA的 3＇ OH上，加上 dNTP DNA和 RNA的修飾酶 載體 DNA與目的基因的連接 宿主系統(tǒng) ? 用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細胞 ? 受體細胞應(yīng)具備的條件 ? 各種基因工程受體的特性 ? 實驗室常用的基因工程受體 受體細胞應(yīng)具備的條件 ? 限制性缺陷型 ? 外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（ recB， recC， hsdR） ? 重組整合缺陷型 ? 用于基因擴增或高效表達的受體細胞（ recA） ? 具有較高的轉(zhuǎn)化效率 ? 具有與載體選擇標(biāo)記互補的表型 ? 感染寄生缺陷型 ? 防止重組細菌擴散污染，生物武器除 ? 對于表達用宿主細胞還應(yīng)該有： ①有較好的翻譯后加工機制 ②蛋白水解酶基因缺陷或表達水平低，以減少外源蛋白的降解實現(xiàn)高效表達 各種基因工程受體的特性 ? 大腸桿菌 ? 遺傳背景清楚，載體受體系統(tǒng)完備，生長迅速，培養(yǎng)簡單，重組子 ? 產(chǎn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多的內(nèi)毒素 ? 適用于外源 DNA的擴增和克隆、原核生物基因的高效表達、基因文庫的構(gòu)建，是 DNA重組實驗和基因工程的主要受體菌 各種基因工程受體的特性 ? 枯草桿菌 ? 遺傳背景清楚，蛋白質(zhì)分泌機制健全，生長迅速，培養(yǎng)簡單，不產(chǎn)內(nèi)毒素 ? 遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備 ? 適用于原核生物基因的克隆、表達以及重組蛋白多肽的有效分泌 各種基因工程受體的特性 ? 鏈霉菌 ? 抗生素的主要生產(chǎn)者，分子遺傳相對操作簡便，不產(chǎn)內(nèi)毒素 ? 主要用于抗生素生產(chǎn)菌株的改良 ? 遺傳不穩(wěn)定，生長相對緩慢 各種基因工程受體的特性 ? 酵母菌 ? 具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)簡單，外源基因表達系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定 ? 內(nèi)源性蛋白產(chǎn)物種類繁多且含量高 ? 適用于外源 DNA的擴增、克隆以及真核生物基因的高效表達、基因文庫的構(gòu)建、真核生物基因表達調(diào)控的研究，是 DNA重組實驗和基因工程重要的真核性受體菌 各種基因工程受體的特性 ? 昆蟲細胞（家蠶） ?