【正文】 第十章外源基因表達(dá)與基因工程藥物 第一節(jié) 概 述 ? 外源基因的表達(dá)：利用細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶系及其調(diào)控系統(tǒng)，將外源基因轉(zhuǎn)錄成肽鏈或加工成活性蛋白質(zhì)的過程。 ? 具體的說，利用分子生物學(xué)技術(shù)，在體外將編碼外源蛋白質(zhì)的基因重組至適宜的表達(dá)載體上，通過相關(guān)技術(shù)將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，借助宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后修飾酶系及相應(yīng)的調(diào)控系統(tǒng)，在宿主細(xì)胞合成或分泌具有原有生物活性的蛋白質(zhì)。 ? 目的：針對難以或無法從自然界直接提取、分離、純化所獲得的，或制造成本、產(chǎn)量規(guī)模等受限制的，或利用化學(xué)方法無法合成的多肽，蛋白質(zhì)、酶這類生物分子藥物，利用細(xì)胞或組織或器官或生命體的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯及其調(diào)控系統(tǒng)以及翻譯后加工、修飾等體系，按人的意愿生物合成這些生物分子，并從中將表達(dá)產(chǎn)物分離純化至預(yù)期程度，最終加工成藥品。 基因工程概念 基因工程 (geic engineering）是指采用人工方法將不同來源的DNA進(jìn)行重組，并將重組后的DNA引入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖或表達(dá)的過程，從而改變生物特性或創(chuàng)造新的生物類型的技術(shù) 基因工程的發(fā)展史 一、基因表達(dá)基本原理 ? 基因表達(dá) (gene expression)是指儲存遺傳信息的基因在各種調(diào)節(jié)機(jī)制下經(jīng)過一系列步驟表現(xiàn)出其生物功能的整個過程。典型的基因表達(dá)是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)過程。 基因工程技術(shù)的核心是 基因表達(dá)技術(shù)。 基因重組的主要目的是要使目的基因在某一細(xì)胞中能得到高效表達(dá)。 基因表達(dá)在原核生物與真核生物中的差別 原核生物與真核生物肽鏈合成過程的主要差別 原核生物 真核生物 mRNA 一條 mRNA編碼幾種蛋白質(zhì)（多順反子） 一條 mRNA編碼一種蛋白質(zhì)（單順反子） 轉(zhuǎn)錄后很少加工 轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行首尾修飾及剪接 轉(zhuǎn)錄、翻譯和 mRNA的降解可同時發(fā)生 mRNA在核內(nèi)合成，加工后進(jìn)入胞液，再作為模板指導(dǎo)翻譯 核蛋白體 30S小亞基＋ 50S大亞基 ? 70S核蛋白體 40S小亞基＋ 60S大亞基 ? 80S核蛋白體 起始階段 起始氨基酰 tRNA為 fMettRNAfMet 起始氨基酰 tRNA為 MettRNAiMet 核蛋白體小亞基先與 mRNA結(jié)合 ,再與fMettRNAfMet結(jié)合 核蛋白體小亞基先與 MettRNAiMet結(jié)合，再與 mRNA結(jié)合 mRNA中的 SD序列與 16S rRNA 3?端的一段序列結(jié)合 mRNA中的帽子結(jié)構(gòu)與帽子結(jié)合蛋白復(fù)合物結(jié)合 有 3種 IF參與起始復(fù)合物的形成 有至少 10種 eIF參與起始復(fù)合物的形成 延長階段 延長因子為 EFTu、 EFTs和 EFG 延長因子為 eEF1α、 eEF1βγ和 eEF2 終止階段 釋放因子為 RF RF2和 RF3 釋放因子為 eRF 蛋白質(zhì)合成的特點 的蛋白質(zhì)合成與 mRNA的轉(zhuǎn)錄分開進(jìn)行 原核生物 的蛋白質(zhì)合成與 mRNA的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)在一起同時進(jìn)行 中的 mRNA為單順反子 原核生物 中的 mRNA為多順反子 合成體系中的 RNA和蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上與原核生物不同，且其線粒體有獨立的蛋白質(zhì)生物合成體系 阻遏蛋白介導(dǎo)的負(fù)調(diào)控和 cAMPCAP介導(dǎo)的正調(diào)控共同擔(dān)負(fù)著原核生物體內(nèi)糖源的協(xié)調(diào)利用 翻譯水平的調(diào)控是對原核生物轉(zhuǎn)錄水平的補(bǔ)充 提高了基因表達(dá)調(diào)控的有效性 影響翻譯起始速率 mRNA的結(jié)合實現(xiàn)翻譯起始的調(diào)控 影響翻譯的延伸速度 基因表達(dá)調(diào)控的影響因素 —— 原核生物 （ 一） 真核生物染色質(zhì)結(jié)構(gòu) 影響基因轉(zhuǎn)錄 超螺旋構(gòu)象 （二） 順式作用原件 （啟動子、增強(qiáng)子和沉默子）直接影響基因表達(dá)活性 （三） 轉(zhuǎn)錄因子 的調(diào)控 （四）真核生物在轉(zhuǎn)錄后仍可控制 mRNA的結(jié)構(gòu)和功能，其在 轉(zhuǎn)錄后層次 不同于原核生物 基因表達(dá)調(diào)控的影響因素 —— 真核生物 目標(biāo)蛋白性質(zhì) 是否需要糖基化 三維結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度 簡單結(jié)構(gòu) 復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu) 原核表達(dá)系統(tǒng) 真核表達(dá)系統(tǒng) 是 否 二、基因表達(dá)基本類型 原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌系統(tǒng)，芽孢桿菌系統(tǒng)等 產(chǎn)物溶解情況 表達(dá)位置 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)狀態(tài) 轉(zhuǎn)基因動植物 酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和動物細(xì)胞等 包涵體 可溶性 胞內(nèi) 定位表達(dá) 分泌表達(dá) 非融合表達(dá) 融合表達(dá) 第二節(jié)外源基因表達(dá)基本過程 ? 將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞，使該基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá) ? 【 四個要素 】 ? 工具酶、載體、基因和受體（宿主）細(xì)胞 基因工程的基本過程 1. 目的基因的獲取 ：從生物體中分離或人工合成 2. 重組載體的構(gòu)建 ：對目的基因和載體 DNA進(jìn)行剪切、修飾，在連接酶的作用下連接形成完整有復(fù)制能力的重組體 3. 重組 DNA分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞 ：重組 DNA分子引入受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增 基因工程的基本過程 4. 重組體的篩選與鑒定 ：直接篩選法 (如抗藥標(biāo)志選擇 )和免疫學(xué)方法 5. 目的基因的表達(dá)及分離純化 ：原核與真核表達(dá) 一、目的基因的獲得 ? 外源基因表達(dá)的第一步是獲得目的基因 ? 獲得目的基因的主要方法包括： ①化學(xué)合成 ② RTPCR從含有目的基因的總 RNA或mRNA中擴(kuò)增 ③從 cDNA文庫或基因組文庫中 PCR擴(kuò)增 ④通過雜交技術(shù)篩選 ⑤利用合適的篩淘技術(shù)從各種文庫中篩選 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) PCR（ polymerase chain reaction） : 在體外由引物介導(dǎo)的、酶促快速合成擴(kuò)增特定基因或 DNA片段的一種方法。 原理 在適當(dāng)緩沖液（ Mg2+）反應(yīng)體系中，根據(jù)堿基配對原理利用 DNA聚合酶催化和 dNTPs的參與下，引物依賴于 DNA模板特性指導(dǎo) DNA合成 基本步驟 1. 變性： 雙鏈 DNA解離成為單鏈 (90℃ 以上 ) 2. 退火 (復(fù)性 )： 引物與模板 DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合（ 50 ℃ 左右） 3. 延伸： DNA模板 引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對原則，合成一條新的互補(bǔ)鏈 （ 70 ℃ 左右） PCR反應(yīng)五要素 ? 引物、酶、 dNTP、模板和 Mg2+ ? PCR反應(yīng)的特異性決定因素： 引物與模板 DNA特異正確的結(jié)合 堿基配對原則 Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性 靶基因的特異性與保守性 PCR的應(yīng)用 1. 研究 — 基因克??； DNA測序；分析突變 2. 診斷 — 細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測及診斷 3.