【正文】 第三章 基因工程載體 載體 (vector)是指基因工程中攜帶外源基因進入受體細胞的“運載工具”，其本質(zhì)是 DNA復制子。 必備基本條件 ： ①能在宿主細胞內(nèi)進行獨立和穩(wěn)定的自主復制； ②具有合適的限制性內(nèi)切酶位點； ③具有合適的選擇標記基因。 根據(jù) 來源和性質(zhì) 不同載體可分為 質(zhì)粒載體 、 噬菌體載體 、 黏粒載體 、 噬菌粒載體 、 病毒載體 、 人工染色體 等。 根據(jù) 功能和用途 不同載體可分為 克隆載體 、 表達載體 (標簽載體、分泌載體 )、 測序載體 、 轉(zhuǎn)化載體 、 多功能載體 等。 根據(jù) 受體細胞 不同載體分為 原核生物載體 (大腸桿菌載體 )、真核生物載體 (酵母載體、植物載體、動物載體 )。 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 質(zhì)粒載體大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適當改造而成的，共同具有 復制必需區(qū) 、 選擇標記基因 、 限制性酶切位點 (克隆位點 )。 一、質(zhì)粒的一般生物學特性 質(zhì)粒是染色體外能自我復制的小型 DNA分子，大小為1~200kb以上。存在于 細菌 (最廣泛 )、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中。 質(zhì)粒的分子特性 雙鏈環(huán)形 DNA(絕大多數(shù) )、雙鏈線形DNA、 RNA(酵母的殺傷質(zhì)粒 )。 提取的質(zhì)粒有三種構型：① 閉合環(huán)形DNA(超螺旋構型 )，② 開環(huán)形 DNA，③ 線形 DNA。 質(zhì)粒的復制類型 嚴緊型 ： 嚴格受宿主控制， 1~3拷貝 松弛型 ： 不嚴格受宿主控制， 10~200拷貝 質(zhì)粒的復制類型與宿主有關，如 R1質(zhì)粒在大腸桿菌中是嚴緊型，而在奇異變形桿菌是松弛型； ColE1K30質(zhì)粒與R1質(zhì)粒正好相反。 大多數(shù)質(zhì)粒載體的復制起始區(qū)都來源于 pMB1質(zhì)粒 ，正常情況下在宿主細胞中可維持至少 15個拷貝。 氯霉素、或鏈霉素等存在可使質(zhì)粒的拷貝數(shù)達到幾千個。 質(zhì)粒的不親和性 質(zhì)粒的不親和性 (不相容性 )是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種質(zhì)粒不能夠在同一個宿主細胞中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。見下圖 彼此不相容的質(zhì)粒屬于同一個 不親和群 (ColE1/pMB1)，而彼此能夠共存的親和的質(zhì)粒則屬于不同的不親和群 (p15A/ ColE1或 pMB1)。 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性 是指質(zhì)粒從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞的特性。 質(zhì)粒 接合型質(zhì)粒 (自我轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 ):多屬于嚴緊型 非接合型質(zhì)粒 (不能自我轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 ):多屬于松弛型 質(zhì)粒的遷移作用 是指非接合型質(zhì)粒在接合型質(zhì)粒共存時可發(fā)生轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。 如 ColE1(必須具備 nic位點 、 mob基因 ) 二、理想質(zhì)粒載體必須具備的條件 天然質(zhì)粒用作載體的局限性 分子量高、拷貝數(shù)低、合適的單一酶切位點少、選擇標記不合適。 天然質(zhì) 粒 相對分子質(zhì)量 拷貝數(shù) 單一酶切位點 選擇性標記 pSC101 106 （ ） 1~3 EcoR I tetr ColE1 106 20 EcoR I 大腸桿菌素 RSF2124 106 10 EcoR I (BamH I) ampr 理想質(zhì)粒載體的必備條件 ①具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù) ； ②具有若干限制性酶的單一酶切位點 (多克隆位點 ，multiple cloning sites， MCS)； 多克隆位點 (多接頭 ， polylinker，或限制性酶切位點庫）是指載體上人工合成的含有緊密排列的多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點的 DNA片段。 ③具有兩種以上的選擇標記基因； ④缺失 mob基因或 nic位點； ⑤插入外源基因的重組質(zhì)粒較易導入宿主細胞并復制和表達。 三、質(zhì)粒載體的構建 載體構建的基本原則 ①根據(jù)基因操作的工作需要； ②符合理想載體的必備條件； ③ 選擇適合的親本質(zhì)粒提供載體元件 ； ④盡量簡化構建程序。 pBR322的構建 3個親本質(zhì)粒 (見圖 ) Tn3 轉(zhuǎn)座到 pMB1上形成 pMB3； pMB3的 EcoRI*片段重排形成了更小的 pMB8； pSC101的 EcoRI*片段與 pMB8的EcoRI*片段連接形成 pMB9； Tn3 轉(zhuǎn)座到 pMB9上形成 pBR312； pBR312的 EcoRI*片段重排形成pBR313； pBR313的 EcoRII片段重排形成pBR320； pBR313的 PstI片段重排形成pBR318； pBR320的 PstI和 HincII雙酶切片段與 pBR318的 PstI和 HapI雙酶連接形成 pBR322。 4 R1drd19 (Tn3) pMB1 pMB3 pMB8 pSC101 pMB9 pBR312 pBR313 pBR320 1 1 2 3 3 4 5 6 pSF2124 (Tn3) pBR318 7 pBR322 8 pBR322的改良 ①進一步降低載體的大??；如 pAT15 pXf3等。 優(yōu)點： a、失去了 pBR322的HaeII的兩個片段，分子量更小，拷貝數(shù)高 pBR322的~3倍； b、失去了 nic位點，更安全。 pAT153 ② 引入帶單一 EcoRI的選擇標記；如 pBR324(，具有大腸桿菌素 E1基因和免疫 imm基因 )、 pBR325(氯霉素抗性基因 )。 ③ 引入 lacZ’選擇標記基因；如 pUC系列載體 (見下圖 ) ④ 引入 MCS位點；如 pUC系列載體 (見下圖 )。 lacZ’基因 ：大腸桿菌的乳糖操縱子的啟動子和 β半乳糖苷酶氨基端 146個氨基酸 (α肽 ) 的編碼序列。 α互補 ：是指載體表達的 α肽與宿主菌中 F′因子的lacZ’△ M15基因的突變產(chǎn)物結合 (α肽與突變 β半乳糖苷酶的 C端片段結合 )形成具有酶活性的功能蛋白質(zhì)的現(xiàn)象。 藍白斑篩選 (α篩選 )：是指利用外源基因插入載體上lacZ’5’端的多克隆位點而破壞 α互補、不能催化平板培養(yǎng)基中 5溴 4氯 3吲哚 βD半乳糖苷 (Xgal) 形成藍色產(chǎn)物、致使形成白色的重組菌落而篩選出重組子的方法。 四、常用的質(zhì)粒載體類型 克隆質(zhì)粒載體 克隆質(zhì)粒載體是指專用于基因或DNA片段無性繁殖的質(zhì)粒載體。如：